腧穴針刺對急性期偏頭痛大鼠中腦組織SP及其受體NK-1的影響*

唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 鄭淑美崔 海（首都醫科大學，北京 100069）

·研究報告·

腧穴針刺對急性期偏頭痛大鼠中腦組織SP及其受體NK-1的影響*

唐美霞 王 茜 耿俊隆 杜若桑 鄭淑美△崔 海△
（首都醫科大學，北京 100069）

目的 觀察腧穴針刺對偏頭痛大鼠中腦P物質（SP）及其受體NK-1 mRNA表達的影響，為探討針刺治療急性偏頭痛機制提供依據。方法 40只健康Wistar雄性大鼠按隨機數字表法分為空白對照組（A組）、模型對照組（B組）、腧穴電針組（C組）、偽電針組（D組）4組，每組10只。各組按設計方案進行造模，和針刺預防治療后，斷頭取中腦，應用實時定量PCR技術，測定各組大鼠中腦P物質及其受體NK-1 mRNA的表達量。結果 與A組比較，B、C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯增高（P＜0.05）。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低（P＜0.05）。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低（P＜0.05）。結論 針刺能通過下調急性期偏頭痛大鼠中腦SP及NK-1基因表達水平，發揮預防治療偏頭痛的作用，且腧穴針刺療效更佳。

偏頭痛 針刺 P物質 NK-1

【Abstract】Objective：To observe the effect of electroacupuncture on the expression of substance P（SP）and its receptor Neurokinin-1 mRNA in the Mesencephalon in rats with migraine.Methods：40 adult male Wistar rats were equally randomized into 4 groups：the blank group（group A），the model （group B），acupoints electroacupuncture（group C），and non-acupoints electroacupuncture（group D），10 in each group.After modeling and electroacupunture treatment，all rats were decapitated，and Mesencephalon was removed and SP and receptor Neurokinin-1（NK-1）mRNA expression were detected by real-time quantitative PCR.Results：Compared with A group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA rose obviously in the other three groups（P＜0.05）.Compared with B group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA dropped obviously in group C and D （P＜0.05）.Compared with D group，the expression of SP mRNA and NK-1 mRNA of group C dropped obviously（P＜0.05）.Conclusion：Acupoints electroacupuncture can efficiently prevent and treat migraine headache by downregulating gene expression level of SP and NK-1 mRNA，and acupoints electroacupuncture has a better effect.

【Key words】Migraine；Acupuncture；Substance P；NK-1

偏頭痛多為一側或兩側顳部反復發作的搏動性頭痛，發作前可伴視覺、體覺先兆，發作時常伴嘔吐［1］，其發病率一直居高不下，且有逐年增高的趨勢。目前，世界衛生組織已經將偏頭痛列為致殘疾病第19位［2］。近年大量針灸治療偏頭痛的臨床療效觀察表明針刺治療偏頭痛的治療效果顯著，且成本低、安全可靠［3-6］；但針灸治療偏頭痛作用機理尚未明確［7-8］。隨著深入研究，發現多種神經肽與偏頭痛的發作有關［9-13］，其中包括SP、降鈣素相關肽（CGRP）、神經肽Y、神經肽M等等，越來越多地引起人們的關注，而SP與疼痛密切相關［9，12］。NK-1受體作為SP結合最為緊密的受體，與SP一起作為神經遞質在偏頭痛過程中的作用越來越受重視［14］。本研究以P物質及其受體NK-1為研究點，通過對硝酸甘油偏頭痛大鼠模型［15］應用實時定量 PCR （PCR）技術，定量檢測針刺對偏頭痛大鼠中腦SP及其受體NK-1mRNA表達的變化，在基因水平上探討針刺對偏頭痛的治療作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD雄性大鼠40只，體質量（250±50）g，購于首都醫科大學實驗動物部。每4只一個籠子，清潔級實驗室喂養，自由攝食、飲水。飼養溫度（22±1）℃，濕度40%～70%，噪音＜60分貝，換氣次數10～20次/min，光照時間每天12 h（8∶00～20∶00），光照時間模擬晝夜交替；適應性飼養7 d。

1.2 主要試劑、儀器 硝酸甘油注射液由北京益民藥業有限公司生產（批號20150702，1 mL：5 mg），0.9%氯化鈉注射液由江西中牧實業股份有限公司生產 （批號1504047，20 mL），SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×）Universal（美國KAPA Biosystems）。高速冷凍離心機，由Beckman公司生產 （型號Beckman Allgre 21 R）；凝膠成像儀，由上海山富科學儀器有限公司生產（型號BioSens SC 810 B）；分光光度計，由ACTGene公司生產（型號NAS-99）；實時定量PCR儀，由linegene（bioer公司生產（型號TCP0096）；一次性無菌針，由中國蘇州醫療用品廠有限公司生產 （批號2140080，0.25×13 mm）。電針用華佗牌電針儀，由中國蘇州醫療用品廠有限公司生產（型號G-6805-2）。

1.3 分組與造模 40只Wistar雄性大鼠按隨機數字表法分為4組，空白對照組 （A組），模型對照組（B組），腧穴電針組（C組），偽電針組（D組），每組10只。參照文獻［16］中偏頭痛大鼠模型備制方法，采用背部皮下注射硝酸甘油10 mg/kg，復制其模型。觀察急性偏頭痛大鼠造模后30～60 min的行為學癥狀并記錄，以出現往返運動、撓頭、爬籠、咬尾次數增多，以及雙耳發紅癥狀為偏頭痛模型造模成功。

1.4 針刺穴位選擇 腧穴電針組根據針灸臨床治療偏頭痛經驗穴［17-19］，同時參照華興邦等制定的《實驗動物穴位圖譜》，取雙側太陽、風池、單側太沖、足臨泣進行針刺治療；偽電針組選擇非經非穴點，本研究沿用楊旭光等［20］臨床研究選擇非穴位點，選擇4個非經非穴位點進行針刺治療，非穴位點1）臂內前緣三角肌與肱二頭肌交界處；非穴位點2）肱骨內上髁與尺骨腕部的中點，尺側緣；非穴位點3）足三里水平旁開非穴位點，脛骨外側緣處；非穴位點4）肘內側，肘尖與腋窩連線中點。常規消毒，直刺0.25～0.30 mm，將G-6805-2型電針儀。疏波，頻率2～5次/s，強度0.1～0.2 mA，留針20 min，每日上午針灸1次。

1.5 干預方法 A組正常飼養7 d，不進行任何處理，第8日皮下注射0.9%氯化鈉注射液2 mL/kg。B組正常飼養7 d，不進行任何處理，第8天皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。C組腧穴電針治療7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。D組非腧穴電針治療7 d，20 min/d，第8日皮下注射硝酸甘油10 mg/kg造模。造模成功后，A、B組不進行任何處理；C組給予20 min腧穴電針1次；D組給予20 min非腧穴電針1次。

1.6 標本采集及指標檢測 治療結束后，在2～4 h內，水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦，快速剝離大腦，取中腦組織，50～100 g置于液氮中，立即保存于-70℃冰箱中備用。檢驗中腦組織SP及NK-1 mRNA表達。1）樣本總RNA提取：取中腦組織25～30 mg，分別加入300 μL裂解液RL，按試劑說明書操作步驟進行總RNA提取。使用紫外光分光光度計檢測樣本RNA的純度與濃度；樣本RNA在260 nm和280 nm處波長下的吸光度，讀取A260/A280比值，來檢測樣本RNA純度，要求其比值范圍在1.8～2.2之間；并計算RNA濃度為A260×40（ng/μL）。取8 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳。2）cDNA：用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，實驗操作按產品說明書進行。反應體系20 μL。放入eppendorf梯度PCR儀中，65℃5 min，37℃40 min，70℃10 min進行反轉錄。得到的cDNA放置在-70℃冰箱保存備用。3）SYBR GreenⅠ實時定量PCR：檢索SP、NK-1特異性引物，使用ncbi-primer對引物進行設計與調試，引物合成。目的基因引物序列（5′to 3′）如下：SPF為CTGGTCCGACAG TGACCAAA，SPR為TCTGCATTGCGCTTCTTTC，擴增產物大小為227 bp；NK-1 RF為GGCCTTTCCACAAGGC TACT，NK-1 RR為TGTACGCGTAGCCGATCAC，擴增產物大小為167 bp；Beta-actinF為CCCATCTATGAGG GTTACGC，Beta-actinR為TTTAATGTCACGCACGATT TC，擴增產物大小為150 bp。20 μL反應體系，其中包括SYBR Master Mix（2×）Universal 10 μL，Primer F （10 μm）1.5 μL，Primer R（10 μm）1.5 μL，模板3 μL，ROX校正染料0.5 μL，ddH2O 3.5 μL補齊至20 μL。以上各樣本均做3個復孔。用PCR儀進行擴增，擴增條件為：95℃10 min，（95℃10 s，59℃60 s）×45個循環。在擴增條件中加入溶解曲線分析，分析模式為：95℃15 s，72℃15 s，95℃15 s。再采用2-△△ct方法進行數據的相對定量分析。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件處理。計量資料以 （±s）表示，組間均數比較采用One-way ANOVA進行分析。計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

各組大鼠中腦組織中SP mRNA、NK-1 mRNA表達比較 見表1。與A組比較，B、C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯增高（P＜0.05）。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低 （P＜0.05）。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低（P＜0.05）。

3 討 論

針刺是中醫學經過幾千年沉淀的經驗精華之一。

表1 各組大鼠中腦組織中SP mRNA表達比較（±s）

表1 各組大鼠中腦組織中SP mRNA表達比較（±s）

與A組比較，△P＜0.05；與B組比較，◆P＜0.05；與D組比較，﹟P＜0.05。

?

近年許多研究者對其進行研究，尤在鎮痛方面的研究頗多，且取得了一定的成就。本研究根據臨床經驗選取了雙側太陽、風池［21］，單側太沖、足臨泣；以少陽經［22］為主，遠近配穴［16］更有效的治療偏頭痛。電針選擇疏波，不斷地刺激腧穴可改善血流，舒張血管，緩解疼痛，減少發作頻率。已有研究證明電針影響痛覺傳遞，以及神經肽的釋放，從而對偏頭痛有積極預防治療作用［23］。本研究中，通過行為學觀察，C組往返運動、撓頭、爬籠、咬尾癥狀較B、D組明顯緩解，且D組較B組的行為學癥狀明顯緩解；通過RT-PCR方法，檢測到C組大鼠中腦SP、NK-1 mRNA表達量均明顯降低，說明電針可以下調急性期偏頭痛大鼠中腦SP、NK-1的基因表達，達到預防治療作用；同時也證明C組相較D組療效更佳。

SP作為一級傷害性傳入纖維末梢釋放的神經遞質，對痛覺的傳遞也起著重要作用［24］。SP主要分布在腦內，其中中腦含量最高，尤其中腦導水管周圍灰質區（PAG）［25-26］。SP被作為是一種神經遞質與神經調節，可通過多種受體 （主要是NK-1受體）參與第二信使偶聯。當神經受刺激后，SP與NK-1受體結合發揮生理作用，參與痛覺傳遞［27］。目前研究認為SP既可以傳遞痛覺信息、參與信號傳導，又有產生疼痛的作用，與痛覺關系密切［28］。

本研究通過RT-PCR，對各組大鼠中腦SP、NK-1 mRNA進行定量分析，結果發現與A組比較，B、C、D 組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯增高。與B組比較，C、D組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低。與D組比較，C組SP mRNA、NK-1 mRNA表達量明顯降低。提示偏頭痛大鼠中腦SP、NK-1表達量增加；以上提示SP及NK-1與偏頭痛的發作密切相關。

本研究結果示，腧穴針刺治療急性期偏頭痛療效確切，并能緩解急性期癥狀。因此，筆者推斷急性偏頭痛的發生與SP及其受體NK-1的釋放量有關，SP通過受體NK-1傳導痛覺，產生致痛作用，促使急性期偏頭痛的發生。針刺可下調SP、NK-1基因表達水平，發揮防治偏頭痛的作用。

［1］ 聞路瓊.針刺治療偏頭痛急性期臨床療效評價［J］.中國社區醫師，2015，29（14）：98-99.

［2］ Thornton E，Vink R.Substance P and its tachykinin NK-1 receptor：a novel neuroprotective target for Parkinson′s disease［J］.Neural Regen Res，2015，10（9）：1403-1405.

［3］ 張銀開.針刺治療偏頭痛66例療效觀察［J］.上海中醫藥雜志，2012，38（3）：61.

［4］ 郭偉，饒華金.針刺治療偏頭痛療效觀察［J］.上海針灸雜志，2011，30（5）：289-290.

［5］ 梁日楚.針刺治療偏頭痛臨床療效觀察［J］.中國醫藥導刊，2011，13（5）：775-776.

［6］ 孫赫楠.針刺治療偏頭痛84例療效觀察［J］.中國衛生標準管理，2014，5（9）：54-55.

［7］ 江建忠，王倩，顧沿泊，等.國內外偏頭痛2004-2013年研究熱點分析［J］.腦與神經疾病雜志，2015，23（2）：121-126.

［8］ 趙維民，張波.偏頭痛發病機制的研究進展［J］.中醫藥臨床雜志，2015，27（1）：125-127.

［9］ 趙國敏，尹金淑.P物質及其受體神經激肽1受體與疼痛的相關性研究［J］.醫學綜述，2015，22（16）：2890-2893.

［10］申崇標，曾照芳.降鈣素基因相關肽與偏頭痛關系的研究［J］.生物信息學，2010，8（1）：57-59.

［11］Fusayasu E，Kowa H，Takeshima T，et al.Increased plasma substance P and CGRP levels，and high ACE activity in migraineurs during headache-free periods［J］.PAIN，2007，128 （3）：209-214.

［12］Schmidt MJ，Roth J，Ondreka N，et al.A potential role for substance P and interleukin-6 in the cerebrospinal fluid of cavalier king charles spaniels with neuropathic pain［J］.J Vet Intern Med，2013，27（3）：530-535.

［13］Hirsch S，Birklein F.Pain-relieving effect of CGRP antagonism on inflammatory pain［J］.Schmerz，2014，28（5）：532-535.

［14］May A，Goadsby PJ.Substance P receptor antagonists in the therapy of migraine［J］.Expert Opin Investig Drugs，2001，10 （4）：673-678.

［15］姜磊，于生元，董釗.實驗性偏頭痛動物模型研究現狀［J］.中國比較醫學雜志，2008，18（8）：62-64.

［16］孟憲慧，張治國，向麗華.遠近配穴法針刺對偏頭痛模型大鼠血漿CGRP及ET-1的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2014，20（5）：664-665.

［17］閆明，張貝貝，任璐璐，等.針刺治療偏頭痛選穴的臨床研究概述［J］.河南中醫，2015，40（5）：1149-1151.

［18］馮菲菲.針灸治療偏頭痛選穴組方規律的文獻研究［D］.廣州：廣州中醫藥大學，2013.

［19］高玉杰.針刺少陽經特定穴對偏頭痛患者腦功能動態影響的研究［D］.成都：成都中醫藥大學，2012.

［20］楊旭光.循經取穴針刺治療偏頭痛的臨床隨機對照研究［D］.成都：成都中醫藥大學，2009.

［21］劉波.針刺“頭四關穴”治療偏頭痛的臨床與實驗研究［D］.哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2004.

［22］陳勤.少陽經穴針刺治療偏頭痛的代謝組學研究［D］.成都：成都中醫藥大學，2009.

［23］任旭，牛爭平.降鈣素基因相關肽在偏頭痛發病機制中的研究進展［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2004，2（4）：229-231.

［24］姜波，李清美，于素清，等.女性偏頭痛患者血漿中β-內啡肽和P物質含量的定量分析［J］.中華神經科雜志，1999，45 （1）：59-60.

［25］Harrison S，Geppetti P.Substance p［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33（6）：555-576.

［26］黃衛，李海標，盧光啟.P物質在大鼠腦室管膜中定位分布的免疫組織化學研究［J］.解剖學報，1996，44（2）：158-160.

［27］鄭淑美，陳玉靜，崔海.基于大鼠中腦SP及其受體變化探討針刺治療偏頭痛作用機制［J］.世界中醫藥，2014，9（7）：961-964.

［28］石宏，景向紅，邱恩超，等.電針對偏頭痛大鼠的皮層擴展性抑制以及體內神經肽含量的影響［C］.中國針炙學會經絡分會第十屆學術會議，2009：209-212.

Effects of Acupoint Electroacupuncture on Mesencephalon Substance P and Its Receptor Neurokinin-1 in Rats with Acute Migraine

TANG Meixia，WANG Qian，GENG Junlong，et al.Capital Medical University，Beijing 100069，China.

·研究報告·

R246 文獻標志碼：A

1004-745X（2016）08-1474-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.08.006

首都中醫藥研究專項（15ZY21）

（電子郵箱：13142104158@163.com）

2016-04-28）