兒童反復呼吸道感染外周血Th17細胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A/白蛋白比值變化及其意義

張琳，　何德根，　陳慧

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臨床論著

兒童反復呼吸道感染外周血Th17細胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A/白蛋白比值變化及其意義

張琳，何德根，陳慧

目的探討兒童反復呼吸道感染(RRTIs)外周血Th17細胞、唾液中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)與血清白蛋白(ALB)比值變化及其意義。方法2014年10月至2015年7月廣州中醫藥大學附屬中山市中醫院兒科收治RTTIs患兒100例，其中急性期和緩解期各50例。同期選取門診體檢的健康兒童50例為正常對照組。流式細胞儀檢測Th17細胞表達率，酶標儀檢測唾液中sIgA，免疫比濁法檢測ALB。結果RRTIs患兒急性期組、緩解期組外周血Th17細胞數較正常對照組患兒增高，差異有統計學意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組外周血Th17細胞數高于緩解期組，差異有統計學意義(P<0.05)。外周血中Th17陽性細胞數與呼吸道感染嚴重程度呈正相關(P<0.05)。正常對照組唾液中sIgA與血清白蛋白比值顯著高于RRTIs患兒急性期組、緩解期組，差異有統計學意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組與緩解期組唾液中sIgA與血清白蛋白比值比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論RRTIs患兒外周血Th17細胞表達增加，且與其病情的嚴重程度呈正相關。RRTIs患兒存在黏膜免疫功能低下，增強呼吸道免疫功能能從根本上減少RRTIs的發作。

反復呼吸道感染；Th17細胞；唾液分泌型IgA；免疫；兒童

兒童反復呼吸道感染(recurrent respiration tract infections，RRTIs)是兒科門診常見的疾病，也是一種非常復雜的疾病。RRTIs病程中與氣道高反應性、黏膜免疫功能紊亂、免疫功能低下密切相關[1]。分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，sIgA)/白蛋白(albumin，ALB)能直接反映患兒呼吸道的黏膜免疫功能，外周血Th17細胞與病毒、細菌等感染密切相關[2-4]。本研究探討RRTIs患兒唾液中sIgA/ALB、外周血Th17在病程急性期、緩解期與健康兒童的差異，探討其與RRTIs患兒病程及病情輕重的關系，研究RRTIs的免疫學改變。

1　資料與方法

1.1臨床資料2014年10月至2015年7月廣州中醫藥大學附屬中山市中醫院兒科收治RTTIs患兒100例，其中急性期和緩解期各50例。RRTIs急性期組中男23例，女27例；年齡3～8歲，平均(5.4±2.4)歲。緩解期組中男28例，女22例；年齡3～8歲，平均(6.5±2.0)歲。同期選取門診體檢的健康兒童50例為正常對照組，其中男24例，女26例；年齡3～8歲，平均(5.9±2.2)歲。3組受試對象在年齡、性別方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2診斷標準參照中華醫學會制定的《反復呼吸道感染的臨床概念與處理原則》[5]進行診斷，RRTIs 1年以內上、下呼吸道感染頻數超出正常范圍。

1.3納入標準(1)符合RRTIs的診斷標準；(2)年齡3～8歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4排除標準(1)RRTIs急性期患兒患病超過3 d，標本收集前2周使用免疫抑制劑、免疫增強劑者；(2)RRTIs緩解期患兒近期有急性上呼吸道感染史，標本收集前2周使用免疫增強劑者；(3)正常對照組患兒有心肺及過敏性疾病、急性呼吸道感染等，標本收集前2周使用免疫抑制劑、免疫增強劑及激素類藥物者。

1.5檢測方法

1.5.1sIgA/ALB檢測取所有研究對象上午10時唾液，具體方法如下：飲入漱口水或瓶裝飲用水，用力漱口后，用一次性空針注射器抽取自然分泌唾液5～10 mL，將唾液置于試管內離心(2 000 r/min，離心15 min，離心半徑8 cm)，取上清液于EP管內，將EP管保存于-20 ℃冰箱內待用。嚴格按購買試劑盒操作步驟說明進行檢測。儀器：80-2型離心機(上海醫療器械有限公司)；Bio-Tek E13412E型全自動酶標儀(USA)；MDF-U5411型-20 ℃低溫冰箱(SONY公司)；酶聯免疫吸附法試劑盒(北京北方偉業生物技術有限公司)。抽取清晨空腹血2 mL，檢測ALB，計算sIgA/ALB。

1.5.2Th17細胞檢測新鮮的2 mL靜脈血用等量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋，采用Ficoll密度梯度離心法(使用人淋巴細胞分離液由天津市灝洋生物制品有限責任公司提供)，分離外周血單個核細胞，調整細胞濃度至2×109/L，取2 mL細胞懸液，種植至24孔板(美國Costar公司)，加入0.05 mg/L佛波酯0.1 μg，1 mmol/L離子霉素2 μmol，1.4 mg/L莫能星2.8 μg。充分混勻后置于37 ℃，50 mL/L CO2培養箱中培養4～6 h，2 500 r/min，離心10 min，離心半徑25 cm)，棄上清，PBS洗滌2次后，加入20 μL PE標記的鼠抗人CD4抗體(CD4抗體由美國Biolegend公司提供)。室溫避光孵育30 min。PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定20 min后，3 000 r/min離心5 min，離心半徑17.4 cm)，棄上清，PBS洗滌2次，加入破膜劑(室溫避光孵育20 min后，3 000 r/min離心5 min，離心半徑17 cm)，棄上清，PBS洗滌2次后，采用流式細胞儀檢測。

2　結果

3組兒童外周血Th17細胞表達率、唾液中sIgA與血清白蛋白比值的檢測結果見表1。

表1　3組兒童外周血Th17細胞表達率、唾液中sIgA與血清白蛋白比值的檢測結果±s)

表1結果表明，RRTIs患兒急性期組、緩解期組外周血Th17細胞數較正常對照組患兒增高，差異有統計學意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組外周血Th17細胞數高于緩解期組，差異有統計學意義(P<0.05)。外周血中Th17陽性細胞數與呼吸道感染嚴重程度呈正相關(r=0.838，P<0.05)，呼吸道感染越嚴重，外周血中Th17細胞表達越高。正常對照組唾液中sIgA與血清白蛋白比值顯著高于RRTIs患兒急性期組、緩解期組，差異有統計學意義(P<0.05)；RRTIs患兒急性期組與緩解期組唾液中sIgA與血清白蛋白比值比較差異無統計學意義(P>0.05)。

3　討論

RRTIs是一種小兒常見病，發病率高達20.3%[6]。RRTIs常見的原因有先天解剖因素、免疫缺陷、支原體感染、營養不良、微量元素缺乏等，其中RRTIs與兒童免疫功能低下密切相關已獲共識[7]。研究表明，作為機體內因條件的免疫功能持續異常是RRTIs反復發生的主要病因[8]。黏膜是人體第一道免疫屏障，sIgA是在人體外分泌液中發現的一種IgA抗體，是人類黏膜免疫的主要抗體[9]。支氣管黏膜是免疫系統的重要組成部分，其中最主要的是sIgA。sIgA多聚體的交叉連接效應可阻止微生物與上皮細胞受體之間的相互作用，從而封閉了其黏附到黏膜上皮細胞，進而入侵機體的致病途徑[9]；而在選擇性sIgA缺乏者，機體循環免疫復合物水平比正常人顯著增高，易患消化道和呼吸道感染等的發生率也顯著增高[10]。唾液中的sIgA可直接反映黏膜免疫功能狀態，但受血液IgA漏出的影響，不宜作為直接的檢測指標。由于尚無確切研究證明血液中的IgA與氣管黏膜的sIgA有必然相關性，若單純檢測血液中的免疫球蛋白來評估黏膜免疫功能不具有充分的科學依據且暫無確切試驗。ALB是維持血漿膠體滲透壓的主要功能蛋白(大約構成80%的膠體滲透壓)，ALB的濃度反映黏膜滲透性，因此，以唾液中sIgA與血液ALB濃度的比值作為檢測指標，可以減少血液IgA漏出帶來的檢測誤差，得到相對準確的結果。本研究發現，RRTIs患兒急性期、緩解唾液sIgA/ALB較正常兒童顯著減少，反復的呼吸道感染導致sIgA合成障礙和免疫受損，向黏膜表面轉運又受影響，這既是反復感染的結果，也是容易再次感染的原因。本研究中RRTIs患兒急性期、緩解期唾液sIgA/ALB并無明顯變化，表明在患兒RRTIs期間，黏膜免疫功能持續低下，病情暫時緩解時，黏膜免疫功能并未改善。

Th17細胞是近年發現的一種新的效應性CD4+T細胞亞群[11]，其主要產生IL-17A、IL-17F等細胞因子[12]，故在宿主防御及炎癥性疾病中起重要的作用。但在其對抗機體內多種細菌、真菌、病毒感染的同時，也可能通過炎癥反應而引起病理性損傷[13]。本研究發現，RRTIs患兒Th17細胞表達率均高于健康對照組，且急性期增高更明顯(P<0.05)。進行直線相關分析后發現，外周血中Th17細胞表達與呼吸道感染嚴重程度呈正相關(P<0.05)，呼吸道感染越嚴重，外周血中Th17細胞表達越高。說明RRTIs過程中，Th17細胞發揮了一定的抗感染效應，同時又可導致免疫損傷，引起呼吸道感染的反復發生。綜上，RRTIs患兒體內存在Th17高表達，同時存在氣道黏膜免疫下降，如能增強患兒的氣道黏膜免疫功能，同時避免疾病過程中引起的進一步免疫損傷，就可縮短病程，改善預后。

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(本文編輯：劉穎)

Changes of Th17 cells in peripheral blood and the ratio of sIgA/ALB in saliva in children with recurrent respiratory tract infection and their significance

ZHANGLin，HEDegen，CHENHui.

DepartmentofPediatrics,ZhongshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Zhongshan528400，China.

ObjectiveTo observe and explore the significance and changes of Th17 cells in peripheral blood and ratio of sIgA/ALB in human saliva.MethodsA total of 100 RRTIs children were divided into two groups: acute group(n=50) and remission group(n=50).Another 50 normal healthy children were included as the control group. The expression rate of Th17 cells was detected by flow cytometry, the expression rate of sIgA in saliva was detected by enzymatic-reader,and the ALB was detected by immune turbidity method.ResultsThe circulating frequencies of Th17 cells in acute and remission group were higher than those in healthy control group(P<0.05), while those in acute group were higher than those in remission group(P<0.05).There were significantly difference in these groups(P<0.05). The circulating frequencies of Th17 cells were positively correlated with the severity of recurrent respiratory tract infection(P<0.05). The ratio of sIgA and serum albumin in saliva in healthy control group was significantly higher than that of acute group and remission group in RRTIs children(P<0.05),but that was no significant difference between acute and remission group(P>0.05).ConclusionThe circulating frequencies of Th17 cells in RRTIs children are increased, and are positively correlated with the severity of the RRTIs. The function of mucosal immune function in RRTIs children is low, so enhancing the immune function of the respiratory tract can fundamentally reduce the attack of RRTIs.

Recurrent respiratory tract infections(RRTIs);Th17 cells;SIgA in saliva;Immune;Child

中山市科技計劃項目(2015B1207)

528400 廣東 中山，廣州中醫藥大學附屬中山市中醫院兒科

張琳(1978-)，女，醫學碩士，副主任醫師。研究方向:小兒腎病的中西醫診斷與治療

陳慧，E-mail：530656552@qq.com

10.3969/j.issn.1674-3865.2016.04.005

R725.6

A

1674-3865(2016)04-0387-03

2015-10-19)