神闕散治療痛風性關節(jié)炎的藥效學研究*

韋興邦，潘國君，林 涵，王穎莉，李樹春

（1.江陰善韋生物科技有限公司，江陰 214400；2.中央民族大學，北京 100081）

Abstract:［Objective］To establish the HSCCC method for separating the gentianine from the alkaline ethanol extracts of gentiana.［Methods］Separation and purification of gentianine by TBE300B HSCCC technology，through the optimization of the solvent system，with n-hexane∶ethyl acetate∶methanol∶water（5∶5∶4∶6）as the solvent system，the upper as stationary phase and the next phase as mobile phase，the rotational speed of the instrument was 850 r/min，the flow rate was 1.5 mL/min，the temperature was 25℃，the detection wavelength was 280 nm.［Results］The gentianine was obtained from the gentian alkaline ethanol extracts by D151 cation exchange resin combining with HSCCC，the content was above 98.8%.［Conclusion］The method is stable and has high results，it could be used to separate gentianine efficiently from alkaline ethanol extract of gentiana.
Key words:Gentiana scabra Bunge；gentianine；HSCCC

神闕散治療痛風性關節(jié)炎的藥效學研究*

韋興邦1，潘國君1，林 涵2，王穎莉2，李樹春2

（1.江陰善韋生物科技有限公司，江陰 214400；2.中央民族大學，北京 100081）

［目的］探討神闕散對模型大鼠痛風性關節(jié)炎的治療效果。［方法］分別建立大鼠高尿酸血癥和痛風性關節(jié)炎模型，全自動生化分析測定大鼠的尿酸、肌酐、尿素氮，探討神闕散對高尿酸血癥的治療作用；測定腫脹指數(shù)變化，同時取各組大鼠的骨組織進行石蠟包埋、蘇木精-伊紅（HE）染色進行病理學分析，評價神闕散對痛風性關節(jié)炎的治療效果。［結果］兩組實驗組模型和對照均具有統(tǒng)計學差異，說明造模成功。對高尿酸血癥，各給藥組和模型對照組相比尿酸、肌酐、尿素氮均具有統(tǒng)計學意義，而神闕散中、高劑量組差異較為顯著。對痛風性關節(jié)炎，神闕散高劑量組在用藥后2 h即開始對痛風性關節(jié)炎產生藥理作用，對模型大鼠關節(jié)炎腫脹指數(shù)具有顯著降低作用，在用藥后4～8 h治療效果更加顯著，其治療效果與痛風定和秋水仙堿相當。病理結果顯示，神闕散低、中、高劑量組均能改善模型大鼠痛風性關節(jié)炎的病理結果，且低、中、高劑量組呈現(xiàn)明顯的量效關系。中劑量組與痛風定和秋水仙堿療效相當，高劑量組改善作用優(yōu)于痛風定和秋水仙堿。［結論］神闕散治療痛風性關節(jié)炎療效確切。

神闕散；高尿酸血癥；痛風性關節(jié)炎；藥效學

痛風性關節(jié)炎（GA）是由于血液尿酸增高，尿酸鹽結晶（MSU）沉積在關節(jié)囊、滑膜、軟骨、骨質等關節(jié)組織，刺激關節(jié)而引起的關節(jié)滑膜及周圍組織病損及炎癥反應［1］。由于長期嘌呤代謝障礙導致血尿酸增高，而高尿酸血癥及原發(fā)性痛風與肥胖癥、高脂血癥、高血壓病、糖尿病、動脈粥樣硬化等疾病呈顯著正相關［2］，因此痛風性關節(jié)炎對人類健康具有極大的危害［3］。目前治療痛風性關節(jié)炎的藥物主要是秋水仙堿、解熱鎮(zhèn)痛藥、糖皮質激素藥等，其不良反應如胃腸毒性、腎毒性或胃腸道出血等［4-6］，給患者帶來巨大的痛苦。因此，尋求高效低毒的藥物對于治療痛風性關節(jié)炎具有十分重要的意義。

布依族是中華民族大家庭中的一員，人口約有300多萬，布依族歷史悠久，人民勤勞勇敢，曾被譽為“水稻民族”，與其他民族一樣，布依族在發(fā)展和壯大的過程中，也創(chuàng)造了自己獨特、豐富的醫(yī)藥文化。布依醫(yī)認為危害人們身體健康的因素很多，但主要是氣候環(huán)境、飲食及意外傷害3種因素。強調診病時要辨其寒熱，用藥也分涼性藥與熱性藥兩大類，即用涼性藥清其熱，用熱性藥散其寒［7］。由于布依族所處黔西南、黔南地區(qū)氣候炎熱多雨，人群患風濕、類風濕等關節(jié)性疾病較多，因而布依族醫(yī)藥積累了豐富的治療外傷和關節(jié)性疾病的經驗。

神闕散是貴州布依族民間驗方，其藥方組成為九節(jié)風、陰陽蓮及鐵馬鞭等8味云貴高原野生植物藥材，臨床具有疏風通絡，活血化瘀，軟堅散結的功效，多年來一直應用于痛風性關節(jié)炎的治療，其臨床發(fā)揮療效較快，治愈率較高，且無毒副作用。但其治療作用一直缺乏相應的實驗支持，故本研究為神闕散治療痛風性關節(jié)炎提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 神闕散免煎劑在中央民族大學中試實驗室制成。秋水仙堿（購自昆明制藥集團股份有限公司）、痛風定膠囊（購自四川升和藥業(yè)股份有限公司）、氧嗪酸鉀鹽（購自Sigma）、酵母膏（購自北京奧博星生物技術有限公司）、腺嘌呤（購自Sigma）、肌酐檢測試劑盒（購自寧波瑞源生物科技有限公司）、尿酸試劑盒（購自寧波瑞源生物科技有限公司）、尿素氮檢測試劑盒（購自寧波瑞源生物科技有限公司）、脫鈣液（北京中杉金橋進口脫鈣液，批號ZLI-9307）、包埋乙醇和二甲苯（天津永大試劑有限公司）、石蠟（北京北化康泰臨床試劑有限公司，熔點為56～58℃）、乙醇和二甲苯（天津永大試劑有限公司）、蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9615）、分化液（上海源葉生物有限公司）、反藍液（上海源葉生物有限公司）、伊紅染液（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9614）、中性樹膠（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號ZLI-9555）。

1.1.2 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠140只，體質量190～220 g［購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001］，分為高尿酸血癥和痛風性關節(jié)炎兩個實驗組，每個實驗組70只。在高尿酸血癥實驗中，實驗前飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境，按體質量采用完全隨機法分為7組，連續(xù)給藥1周，其中造模前溶媒對照組按照造模方法給予蒸餾水作為模型對照，造模后溶媒對照組為在造模基礎上給予蒸餾水灌胃作為給藥對照，西藥對照組秋水仙堿按體質量給予0.15 mg/kg；中藥對照組痛風定膠囊按體質量給予624 mg/kg；神闕散高劑量組按體質量給予504 mg/kg；神闕散中劑量組按體質量給予252 mg/kg；神闕散低劑量組按體質量給予126 mg/kg；神闕散低劑量1/2組按體質量給予63 mg/kg。在痛風性關節(jié)炎實驗中，用藥組大鼠分為7組：分別為正常組（按照造模方法給予生理鹽水）、對照組（造模基礎上給予生理鹽水灌胃）、西藥對照組秋水仙堿組、中藥對照組痛風定膠囊組、神闕散高劑量組、神闕散中劑量組和神闕散低劑量組，每組10只小鼠，其給藥劑量均與高尿酸血癥給藥相同。

1.1.3 實驗儀器 電子稱（常州市衡正電子儀器有限公司），全自動生化分析儀（東芝，型號TAB-40F2），離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司），尿酸（Sigma），足趾容積測量儀（濟南益延科技發(fā)展有限公司，型號yls-7b），顯微鏡（日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11），CMOS（日本奧林巴斯），多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus），石蠟切片機（德國萊卡RM2015），低溫冰箱（日本三洋MDF-382E型），移液器（德國Eppendorf），恒溫水浴箱（江蘇太倉醫(yī)用儀器廠DSHZ-300型）。

1.2 方法

1.2.1 模型制作 大鼠高尿酸血癥模型的建立：實驗前飼養(yǎng)1周以適應環(huán)境，每組動物自由飲食1周進行給藥，給藥前稱大鼠體質量，除正常組灌胃給予蒸餾水外，其余各組灌胃酵母膏按體質量18 g/kg，腺嘌呤按體質量100 mg/kg。在各組取材前1 h給予氧嗪酸鉀鹽300 mg/kg。

大鼠痛風性關節(jié)炎模型的建立：在無菌條件下將5 mmol/L的氫氧化鈉（NaOH）和800 mg尿酸鈉加入155 mL去熱原的滅菌注射用水中并煮沸，使尿酸鈉完全溶解，自然降溫并攪拌，滴入1 mol/L的鹽酸（HCl）至pH值7.0，溶液呈乳白色后反復離心（3 000 r/min）2 min，最后于4℃冷卻1 h后離心，收集晶體于無菌EP管，4℃保存。烤干上清、燒杯、攪棒和離心管，稱重，將實驗后減去實驗前器械重量加上生成氯化鈉的量即為所得晶體的重量。再將尿酸鹽結晶（MSU）晶體溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）中配成所需濃度。此方法制備的MSU晶體可均勻混懸于PBS中。參照大鼠急性痛風性關節(jié)炎的建立模型［8-9］，麻醉大鼠后，選右踝關節(jié)外側后方為穿刺點，針口斜面朝前上方與脛骨成45°夾角刺入踝關節(jié)腔，以4.5號針頭向關節(jié)腔一次性注入50 μL濃度為20 g/L MSU溶液。

1.2.2 高尿酸血癥及痛風性關節(jié)炎的評價

1.2.2.1 高尿酸血癥實驗 實驗前和實驗后各第7天，眼內眥靜脈取血，離心半徑23 cm，2 500 r/min離心5 min，每份血樣取200 μL上清液測定血清尿酸、肌酐、尿素氮。

1.2.2.2 痛風性關節(jié)炎實驗 用藥組大鼠于誘發(fā)模型前5 d開始灌胃給藥，每日1次，連續(xù)7 d。第2、4、6、8、24、48 h觀察腫脹指數(shù)和組織病理變化。腫脹指數(shù)定義：通過2～3 mm寬紙條和游標卡尺測量實驗前和誘導炎癥后不同時間的關節(jié)周徑，關節(jié)腫脹指數(shù)=（測定時間點關節(jié)周徑-初始周徑）/初始周徑［10］。在此基礎上，取各組大鼠沖洗干凈的骨組織，置于10倍本身體積的脫鈣液［脫鈣液需用乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液］中，每周更換脫鈣液，定期檢查組織酥軟程度（以大頭針輕松扎入骨組織即可），脫鈣完成后，固定、脫水、石蠟包埋、切片，然后進行脫蠟和復水及蘇木精-伊紅（HE）染色，鏡下觀察，采圖分析。治療結束后，將所有的動物處死按照上述方法取材，并記錄相關數(shù)據(jù)。

3 實驗結果

3.1 神闕散治療高尿酸血癥的實驗結果 在尿酸實驗結果中，除痛風定組和神闕散低劑量及1/2低劑量組外，其余給藥組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），可見秋水仙堿、神闕散高劑量組和神闕散中劑量組降低尿酸的療效較為顯著。在肌酐實驗結果中，神闕散高劑量組及神闕散中劑量組差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明神闕散中、高劑量組對降低高尿酸血癥的肌酐具有明顯療效。對于尿素氮實驗結果，神闕散中、高劑量組均具有統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 神闕散對高尿酸血癥模型的治療結果（±s）

表1 神闕散對高尿酸血癥模型的治療結果（±s）

注：與造模后溶媒對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

尿素氮（mmol/L）造模前溶媒對照組 10 36.6±16.112**17.3±1.159** 4.6±0.439**造模后溶媒對照組 10 216.4±49.241 31.0±4.216 8.4±1.729秋水仙堿組 10 159.3±64.031**24.4±5.103** 7.3±0.865痛風定組 10 198.5±59.816 34.6±5.660**10.2±4.516*神闕散高劑量組 10 108.8±39.653**22.4±3.893** 5.9±1.036**神闕散中劑量組 10 93.6±16.853**21.5±2.368** 6.3±1.017*神闕散低劑量組 10 187.6±39.772 29.6±3.272 8.3±0.739神闕散低劑量1/2組 10 199.8±65.140 29.3±7.149 7.8±1.334組別 n 尿酸（μmol/L）肌酐（μmol/L）

3.2 神闕散治療痛風性關節(jié)炎的實驗結果 除正常組外，在給藥前，各組大鼠的腫脹指數(shù)值呈上升趨勢，符合疾病發(fā)展的規(guī)律，給藥2 h后，可見所有實驗組的腫脹指數(shù)升高。4 h后秋水仙堿組、痛風定組以及神闕散高劑量組腫脹指數(shù)降低。6 h后，神闕散低、中、高劑量組腫脹指數(shù)均降低。8 h后所有給藥組均有下降。至48 h后所有實驗組均恢復至給藥前水平。從下降趨勢可以看出除了神闕散低劑量組療效不明顯外，其他給藥組對痛風性關節(jié)炎大鼠均有治療作用，而神闕散高劑量組的作用明顯優(yōu)于其他用藥組，神闕散中劑量組與痛風定組和秋水仙堿組的療效相當。見圖1。

圖1 腫脹指數(shù)升降趨勢圖

由圖2病理結果可見，在低倍顯微鏡和高倍顯微鏡下觀察骨組織，正常組滑膜及周圍組織正常，無炎細胞浸潤，關節(jié)腔清晰，無炎性細胞及滲出物。而對照組滑膜及周圍組織可見大量急、慢性炎細胞浸潤，伴關節(jié)腔內大量滲出物和炎細胞并血管擴張充血。痛風定組的滑膜及周圍組織中度炎癥，可見急、慢性炎細胞浸潤，伴關節(jié)腔內少量滲出物和炎細胞，并血管擴張充血。秋水仙堿組的滑膜及周圍組織中度炎癥，可見慢性炎細胞浸潤，伴關節(jié)腔內少量滲出物和炎細胞，并血管擴張充血。神闕散低劑量組的滑膜及周圍組織中度炎癥，可見急、慢性炎細胞浸潤，關節(jié)腔內有少量滲出物和炎細胞，血管仍然擴張充血。神闕散中劑量組的滑膜及周圍組織輕度炎癥，可見散在急、慢性炎細胞，集中于滑膜區(qū)，關節(jié)腔內未見滲出物和炎細胞。神闕散高劑量組的滑膜及周圍組織正常，偶見炎性細胞，關節(jié)腔清晰，無炎性細胞及滲出物。

圖2 各組大鼠病理形態(tài)（HE染色）

4 討論

目前治療痛風性關節(jié)炎的主要藥物有秋水仙堿、解熱鎮(zhèn)痛藥、糖皮質激素以及中藥痛風定膠囊等。其中臨床一般認為秋水仙堿為治療痛風性關節(jié)炎的首選藥物，痛風性關節(jié)炎發(fā)作最初幾小時內服用療效最好，24 h內療效約有75%，24 h后療效降低，但其有效劑量與中毒劑量相近，使得其療效受到限制。非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥療效較好，適用于對秋水仙堿不耐受者，但不良反應較多，譬如過敏反應、消化道出血等，另外消化性潰瘍病史、腎臟疾病、肝臟疾病、心功能不全以及服用抗凝藥物者慎用，老年患者也應當慎用。糖皮質激素起效快，但停藥后癥狀易復發(fā)，不良反應多。可見西藥治療痛風性關節(jié)炎有許多不良反應［4］。近年來，中醫(yī)藥在改善痛風性關節(jié)炎的癥狀及緩解癥情方面具有明顯的優(yōu)勢，安全性較好，復發(fā)率低［11］。如中藥制劑痛風定片對關節(jié)紅腫熱痛確有療效，能明顯降低血尿酸水平，在臨床中未發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應［12］。

布依族是貴州的土著民族之一，在治療潮濕山區(qū)的多發(fā)病方面總結了許多有效的民族方藥［13］。布依族醫(yī)藥理論認為痛風性關節(jié)炎為外感風寒濕邪，邪阻經絡，內有氣血虧虛。風、寒、痰、濕、熱、虛等交相為害，血瘀絡阻，受累臟腑以脾腎為甚。朱良春教授也認為痛風是濁毒瘀滯血中，不得泄利所致，水谷不歸正化，濁毒隨之內生，滯留血中終致瘀結為患［14］。神闕散是布依族中治療痛風性關節(jié)炎的常用驗方，其中九節(jié)風具有清熱解毒涼血，活血消斑散瘀，祛風除濕通絡的作用，之前的研究顯示九節(jié)風可能是通過穩(wěn)定內皮細胞的代謝活性，調節(jié)由于內毒素休克引起的血管內皮細胞分泌功能以及尿酸鹽引起的血管內皮細胞分泌功能的紊亂，抑制炎癥因子白細胞介素-1（IL-1）的過度釋放，阻斷了炎癥的級聯(lián)反應，從而具有治療作用［15-16］。陰陽蓮提取物能明顯降低血尿酸，其機制為抑制黃嘌呤氧化酶活性，使尿酸的生成減少，血清尿酸水平下降，同時還能明顯降低急性痛風性關節(jié)炎中的炎性因子的含量，緩解炎性癥狀，阻止炎癥狀態(tài)進一步發(fā)展［17］。

本研究從模型動物層面證實神闕散能有效治療模型大鼠痛風性關節(jié)炎，其在顯著降低高尿酸血癥的尿酸、肌酐和尿素氮的基礎上，對急性痛風性關節(jié)炎具有較為明確的治療作用，特別是相比現(xiàn)有用于治療痛風性關節(jié)炎的藥物，神闕散的治療優(yōu)勢較為明顯。同時課題組還進行了神闕散的安全性評價研究，證實了該方劑具有安全無毒副作用的特點［18］，使其成為治療痛風性關節(jié)炎較為理想的藥物。本研究為神闕散的治療作用提供了實驗支持，為神闕散治療痛風性關節(jié)炎的開發(fā)應用提供了一定的實驗基礎。

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Pharmacodynamic study of Shenque powder on gouty arthritis in rats

WEI Xing-bang1，PAN Guo-jun1，LIN Han2，WANG Ying-li2，LI Shu-chun2
（1.Jiangyin Shanwei Biotechnology Co.Ltd.，Jiangyin 214400，China；2.Minzu University of China，Beijing 100081，China）

［Objective］To investigate the treatment effect of Shenque powder on rat gouty arthritis.［Methods］The rat model of hyperuricemia and gouty arthritis were built.By using full automatic biochemical analysis to observe rat's disease activity index like Uric Acid （UA），creatinine，urea nitrogen and swelling index to evaluate the pharmacodynamics of Shenque powder on ratsgouty arthritis.［Results］The model is successful when the model group and control group had remarkable difference in both two groups.After taking medicine，in hyperuricemia model，the Uric Acid （UA），creatinine and urea nitrogen have statistical significance between the administration group and model group，the difference is significant with that in the high and median dose group.In gouty arthritis model，Shenque powder high dose group had pharmacological effects on gouty arthritis began after two hours in drug use，and arthritis rats swelling index was significantly reduced，especially between 4～8 h in drug use（P＜0.05），the same treatment effect with Tongfengding and colchicine.The Uric Acid（UA），creatinine，urea nitrogen，and dwelling index were still high in model group，other treatment group's disease index had decreased.As a result，the high dose group can improve pathology index of gouty arthritis，and the dose-effect relationship was shown among low，median and high dose.The median dose had the equal efficacy and the high dose had superior improving effect compared with Tongfengding and colchicine.［Conclusion］The Shenque powder is effective for gouty arthritis.

Shenque powder；hyperuricemia；gouty arthritis；aharmacodynamics

R589.7

A

1673－9043（2016）01－0048-05

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.01.13

中央民族大學橫向科研項目資助（046-60323509）。

韋興邦（1958-），男，教授，主要從事布依族方藥研究。

李樹春，E-mail：jason@muc.edu.cn。

（2015-09-20）