血清Livin聯合Survivin檢測在視網膜母細胞瘤診斷的應用價值

黃延波　許文敏　洪澤華等

[摘要]目的 探討血清Livin聯合Survivin檢測在視網膜母細胞瘤診斷的應用價值。方法 采用酶聯免疫吸附試驗定量測定40例RB患者和40例非惡性眼病患者的血清Livin、Survivin含量。結果 RB患者的血清Livin、Survivin水平較非惡性眼病患者有統計學意義（P<0.05）。血清Livin、Survivin水平與RB患者的癌組織分化程度和臨床分期顯著相關。血清Livin的最優截斷點為182.5ng/L，敏感度和特異度分別為80.0%和70.0%；血清Survivin的最優截斷點為14.5ng/L，敏感度和特異度分別為87.5%和75.0%；當兩者聯合時，可將敏感度提高至92.5%。結論 血清Livin、Survivin在視網膜母細胞瘤患者中均表達顯著上升，聯合檢測血清Livin、Survivin水平可提高視網膜母細胞瘤的診斷價值。

[關鍵詞]視網膜母細胞瘤；Livin；Survivin；血清；診斷價值

[中圖分類號]R739.7 [文獻標識碼]B [文章編號]2095-0616（2016）11-144-04

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）舊稱“視神經膠質瘤”，是原發于視網膜內顆粒層的胚胎性惡性腫瘤，是兒童最常見的眼內惡性腫瘤，可侵犯單眼或雙眼，惡性程度高，預后較差，對患兒的視力和生命均造成嚴重影響和威脅。因此，早發現、早診斷，以便進行及時有效的治療，是提高治愈率和改善預后的關鍵。Livin是最新發現的一個凋亡抑制蛋白家族（inhibitors of apoptosis protein，IAPs）的成員，在大多數腫瘤中高表達，被認為與腫瘤的發生、發展及預后有重要關聯。Survivin是迄今發現的最強大的凋亡抑制因子，兼有調節細胞周期和抑制細胞凋亡的雙重作用，與腫瘤細胞生長失控、侵襲遷移的能力密切相關。本研究通過檢測RB患者血清中Livin、Survivin的含量，探討兩者在RB患者中表達和診斷的意義，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2012年1月～2015年10月我院收治的40例RB患者作為研究對象。所有患者均經病理檢查確診，其中男22例，女18例，年齡7～63個月，平均（25.0±13.5）個月，按照鮮軍舫的臨床分期分為四期，其中1期（眼球內期）16例，2期（青光眼期）9例，3期（眼球外期）14例，4期（遠處轉移期）1例；按組織病理學分型，未分化型24例，分化型16例。另外選取同期在本院診斷為斜視、先天性白內障或眼部外傷等非惡性眼病，并且各項實驗室檢查指標均正常的40例兒童作為對照，其中男24例，女16例，年齡8～70個月，平均（27.1±14.5）個月。兩組患者均未接受任何治療，均簽署知情同意書。

1.2檢測方法

所有研究對象和健康志愿者均清晨空腹抽取外周靜脈血5mL，置于未加抗凝劑的無菌試管中，30min內3000r/min全血離心10min，抽取上層清液分裝，放置在20℃冰箱中保存，待分批檢測。Livin、Survivin均采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）測定，試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。操作過程嚴格按照說明書進行，每個血清樣本行正、副2個測試孔，最后取其平均值。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據處理和分析。計量資料采用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。應用ROC曲線確定最佳截斷點，同時計算ROC曲線下面積（AUROC），判斷最優截斷點的靈敏度和特異度。

2結果

2.1兩組患者血清Livin、Survivin表達的比較

所有血清樣本中均可檢測到Livin和Survivin的含量。RB患者的血清Livin和Survivin的含量分別為（394.08±219.587）ng/L和（25.25±9.27）ng/L，均顯著高于對照組的（161.68±110.27）ng/L和（13.88±6.72）ng/L，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2血清Livin、Survivin水平與RB患者臨床特征的關系

在不同臨床分期的RB患者比較上，3～4期患者的血清Livin、Survivin表達水平顯著高于1-2期的患者，差異有統計學意義（P<0.05）；在不同癌組織分化程度的RB患者比較上，分化的患者的血清Livin、Survivin表達水平顯著高于未分化的患者，差異有統計學意義（P<0.05）。但在不同性別和年齡的RB組比較上，男和女、>2歲和≤2歲RB組的血清Livin、Survivin表達水平無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3血清Livin、Survivin水平的ROC線面積和最優截斷點

以血清Livin和Survivin水平分別繪制ROC曲線。以182.5ng/L作為截斷值時，血清Livin診斷RB的靈敏度和特異度最高，分別為80.0%和70.0%，ROC曲線下面積為0.832，95%置信區間為0.746～0.918；以14.5ng/L作為截斷值時，血清Survivin診斷RB的靈敏度和特異度最高，分別為87.5%和75.0%，ROC曲線下面積為0.847，95%置信區間為0.762～0.931；當兩者聯合時，只要其中1項為陽性者即為聯合檢查陽性，可將診斷RB的敏感度提高到92.5%，但特異度降低到65.0%。見圖1。

3討論

RB是嬰幼兒最常見的原發性眼內惡性腫瘤，在發達國家，眼內期RB早期診斷和治療后10年生存率可達80%以上，并且通過保守治療來保留眼球和有用視力并不影響生存率。但在發展中國家，許多RB患者確診時已處于眼外期，眼球保存率和生存率往往低于發達國家。因此，早期診斷和盡早治療是關鍵。惡性腫瘤的形成是一個多階段、多基因調控的復雜過程，腫瘤細胞的生長繁殖不僅與癌基因的激活和抑癌基因的突變或缺失有關，還必須逃避各種因素所引起的細胞凋亡。凋亡抑制是腫瘤細胞的一個重要特性，與腫瘤細胞的無限增殖有密切關聯。細胞凋亡是由基因調控的細胞自主性死亡過程，對機體的生長發育、免疫記憶、內環境穩定等有重要作用。近年來多項研究表明，細胞凋亡調控的正常與否與RB的發生、發展和轉歸都有密切的關系，誘導RB細胞凋亡可達到治愈RB的目的。

IAPs是一類在分子結構上具有高度同源性和細胞內源性，能抑制細胞凋亡的蛋白家族，也是目前發現的唯一可以與半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（Caspase）直接結合而起抑制作用的蛋白家族，通過參與腫瘤壞死因子（TNF-α）介導的信號傳遞機制，最后與核轉錄因子（NF-κB）相互作用而發揮抗細胞凋亡的作用。目前已發現的IAP家族有8個成員，其中Livin和Survivin作為新近發現抗凋亡作用最強的成員，兩者均可通過多種信號途徑，調控細胞周期，抑制細胞凋亡。Livin的BIR結構可通過與多種Caspase結合，降低Caspase活性，抑制級聯反應中Caspase間的相互作用和核酸的裂解，從而起到抑制凋亡的作用。Survivin在IAPs家族中分子量為最小，不僅能夠抑制細胞凋亡，調控細胞周期，還具有促進細胞分化和促進血管生成的作用。由于這兩種因子的表達具有高度組織特異性，即在正常成人組織中不表達，在胚胎和胎兒組織中強烈表達，在成熟的終末分化組織中不表達，但在多種轉化細胞和人類幾乎所有惡性腫瘤組織中高表達，因此可作為腫瘤診斷的指標之一。

本研究中，RB患者血清中Livin和Survivin的含量均高于非惡性眼病患者，我們推測高表達的Livin和Survivin可能通過某種信號通路抑制癌細胞的凋亡，從而使腫瘤細胞逃避了凋亡進程，同時也進一步說明了Livin和Survivin在RB的侵襲和進展中扮演重要的角色。此外，有多篇文獻報道了Livin和Survivin表達與惡性腫瘤的預后呈正相關，包括胃癌、骨肉瘤、腸癌等。但目前尚無有關Livin和Survivin表達與RB預后的報道，本研究發現，RB患者血清Livin和Survivin含量與癌組織分化程度和臨床分期密切相關，主要表現為癌組織分化越差，臨床分期越高，血清Livin和Survivin含量越高，提示Livin和Survivin的檢測可作為判斷RB患者療效及預后的指標之一。該結果與孫燕的結果相同，但與孔虹和張萌的報道不盡相同，說明Livin和Survivin在RB中具體機制尚未明確，這也是本領域接下來的主要研究方向。

本研究利用ROC曲線對血清Livin和Survivin診斷RB的價值進行評估。血清Livin以182.5ng/L作為截斷值時，靈敏度和特異度最高，分別為80.0%和70.0%；血清Survivin以14.5ng/L作為截斷值時，靈敏度和特異度分別為87.5%和75.0%，略低于孔虹的研究結果。單獨檢測時，兩者均不能達到較高診斷效能。腫瘤標志物單項檢測時難免會出現一定的漏診率，聯合檢測可彌補這一缺陷。當兩者結合時，其診斷RB的敏感度可提高至92.5%，提示聯合檢測血清Livin和Survivin對于RB診斷具有很好的互補作用，從而提高了RB的檢出率和診斷RB的準確性，具有更好的臨床應用價值。

綜上所述，RB患者血清中的Livin和Survivin表達顯著上升，因此，可以通過檢測這兩種標志物對RB進行早期診斷。當聯合檢測血清Livin和Survivin含量時，可顯著提高RB的診斷價值。