多種癌細胞Nesprin 1蛋白的表達

胡繼宏　賈佳　路娟等

[摘要]目的 通過比較Nesprin 1在不同癌細胞中的表達程度，為Nesprin 1與多種癌細胞之間的關系做初步探討。方法 采用Western blotting方法檢測Nesprin 1在人宮頸癌細胞（Hela）、人肺癌細胞（H-125）、人乳腺癌細胞（HCC-1937）、人膀胱癌細胞（5637）、人肝癌細胞（HepG2）、人胃癌細胞（BGC-823）、人結腸癌細胞（HCT 116）、人食管癌細胞（Eca-109）、小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Raw 2647）等癌細胞當中的表達。結果 各癌細胞組GAPDH均有表達，Nesprin 1各組表達量不同，從強到弱順序為HCC-1937>H-125>HCTll6=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637，其中人膀胱癌細胞5637的表達不明顯。結論 Nesprin 1蛋白可在多種癌細胞中表達，膀胱癌細胞中表達不明顯。

[關鍵詞]Nesprin；癌癥；肺癌；肝癌；胃癌；Hela；HCC-1937

[中圖分類號]R34 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2016）11-31-03

癌癥是被預測為21世紀人類“第一殺手”的疾病。現常見的癌癥有肺癌、肝癌、胃癌、血癌、腸癌、乳腺癌、食道癌、淋巴癌及腎癌等，其中前三者已成為我國癌癥中致死率最高的三大疾病。在癌癥的發生發展過程中，癌細胞是產生癌癥的源頭，癌細胞的瘋狂增殖、浸潤及侵襲是由多種因素作用的結果，人類的干預手段是否有效可以通過調節癌細胞的各種蛋白及核酸的表達來判斷，其表達并不是單型，而是由多種因子組成。

Nesprin是核膜蛋白的組成部分，是一個含多個重復序列的核骨架和細胞骨架蛋白家族。目前已發現此家族由4個基因編碼組成，即Nesprin 1、Nesprin 2、Nesprin 3、Nesprin 4，其中Nesprin 1是目前研究較多的蛋白之一。最近有關nesprin家族細胞功能與腫瘤關系的研究成為熱點，認為其下調或編碼的基因突變可能參與腫瘤的形成，為此可以作為腫瘤診斷和治療的靶點。不同的腫瘤其發生、發展的過程有所不同。本研究預同時觀察Nesprin 1在十種常見腫瘤中的表達情況，為進一步Nesprin 1在腫瘤診斷和治療中作用的研究提供線索。

1材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑

1.1.1細胞 人宮頸癌細胞（Hela）、人肺癌細胞（H-125）、人乳腺癌細胞（HCC-1937）、人膀胱癌細胞（5637）、人肝癌細胞（HepG2）、人胃癌細胞（BGC-823）、人結腸癌細胞（HCT 116）、人食管癌細胞（Eea-109）、小鼠單核巨噬細胞白血病細胞（Raw2647）均由上海吉凱基因提供。

1.1.2試劑 兔單克隆抗體Nesprin 1購于英國Abeam公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，江蘇碧云天公司；RIPA強裂解液，江蘇碧云天公司；Prestained protein marker，美國Thermo公司；ECL-PLUS/kit，美國Thermo公司。

1.1.3儀器 SDS-PAGE蛋白電泳儀（VE-180），上海天能公司；蛋白轉膜儀（VE-186），上海天能公司；冷凍高速離心機，美國Thermo公司；PVDF膜（IPVH00010），millipore公司。

1.2方法

采用Western blotting方法檢測Nesprin 1的表達：收集九種癌細胞，提取蛋白，用BCA法測定蛋白質含量，進行SDS-PAGE、轉膜、封閉后加入抗Nesprin 1多抗（TBST 1：1000稀釋）4℃過夜；加入rabbit IgG（TBST 1：5000稀釋），室溫下孵育1.5h，TBST洗膜，加入ECL底物反應液，放上x線片，關上暗盒，曝光2min；取出光片，放入顯影液中1min，漂洗后放定影液2min曝光。用目的條帶的灰度值比內參GAPDH灰度值代表蛋白相對表達量。

1.3統計學方法

所有數據用SPSS13.0軟件進行統計分析，計量資料服從正態分布用（x±s）表示，多組數據比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD法檢驗（α=0.05）。

2結果

Western blotting結果顯示（見圖1）：各癌細胞組內參（GAPDH）均有表達。除人膀胱癌細胞5637的Nesprin 1表達不明顯外，其余各組均有不同程度表達，根據Nesprin 1蛋白相對表達量比較得出（見圖2），其表達強弱順序為HCC-1937>H-125>HCT116=Eca-109>RAW2647>BGC-823>HepG2>Hela>5637。H-125與HCC-1937兩組的蛋白水平表達相較于其余組最高（均P<0.05），其中HCC-1937的蛋白表達相對H125更高（P<0.05）。HCT116與Eca-109之間無差異（P>0.05），其余各組細胞間均存在明顯差異（均P<0.05）。見表1。

3討論

本實驗中所選癌細胞有Hela、H-125、HCC-1937、5637、HepG2、BGC-823、HCT 116和Eca-109八種，均為臨床上常見疾病，其種系為我國目前研究種類較多，使用頻率較高的類型。可以看到相對于同一參照，不同癌細胞的表達量不一致，其中以人乳腺癌細胞和肺癌細胞含量最高，而膀胱癌細胞最低。目前國內有關癌細胞與Nesprin 1關系研究報道尚未發現，國外一項研究報道，在人類很多的癌癥早期（包括卵巢癌、子宮癌、宮頸癌、腎癌、肺癌、甲狀腺癌、胰腺癌等）均發現Nesprin 1的N端的同形異構體表達下調，不同癌細胞其表達量不同，以肺腺癌細胞（Calu3）、乳腺癌細胞（MCF7）、宮頸癌細胞（Hela）和卵巢癌某些類型（Caov-3、SK-OV-3）表達量較高；而且同樣是卵巢癌細胞，其來源不同，Nesprin 1的DNA表達含量有所不同，與本研究結果類似，亞細胞定位的個體nesprin的變化由細胞類型決定，提示由于不同細胞類型Nesprin的功能不同，其Nesprin 1表達程度也不同。

癌細胞表現為核異型性，與正常細胞的核結構存在顯著差異。細胞核的變形通常用于癌癥的病理診斷及抗癌療效的評價指標。Nesprin蛋白家族是細胞核膜蛋白的重要組成部分，核內膜的Nesprin蛋白家族和核外膜的SUN蛋白家族在細胞核周圍相互作用共同構成了核一細胞骨架鏈接。當這種鏈接破壞，信號通路的損害帶來了細胞核穩定性、大小、形態和位置的改變，并影響細胞的遷移、分化。因此很多研究學者認為Nesprin蛋白家族做為核一細胞骨架的重要組成部分，其異常必然與癌癥相關。現有研究不僅發現Nesprin 1可能在人類很多癌癥早期就已發揮作用，還可能與乳腺癌的惡化進展有關。另有研究報道，在卵巢癌和結腸直腸癌中編碼Nesprin 1蛋白的SYNE1存在基因突變，肺癌和結腸直癌中SYNE1基因存在頻繁的甲基化，并證實SYNE1參與了膠質細胞瘤的惡化。

本實驗沒有設立正常組織對照組，無法得出Nesprin 1與這些腫瘤的相關性，但依然可以看到不同癌細胞的表達量不一致。了解Nesprin 1在不同癌細胞的表達程度，有助于為進一步探討Nesprin 1在腫瘤診斷和防治中的作用。本實驗中，人膀胱癌細胞的Nesprin 1的表達量相較于其他癌細胞較低，是否可以作為鑒別診斷的指標？這需要我們的進一步驗證。