Rab1A siRNA對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制

段　釗，公丕軍，杜　娟，付麗麗（西安交通大學第二附屬醫院婦產科，西安710004；通訊作者，E-mail:duanzhao8 @163.com）

Rab1A siRNA對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響及其分子機制

段釗*，公丕軍，杜娟，付麗麗（西安交通大學第二附屬醫院婦產科，西安710004；*通訊作者，E-mail:duanzhao8 @163.com）

目的觀察Rab1A對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響并探討其分子機制。方法應用siRNA干擾Rab1A基因表達，將HeLa細胞分為空白對照組、陰性對照組和Rab1A siRNA組，空白對照組不做處理，陰性對照組轉染陰性對照siRNA。Rab1A siRNA組轉染Rab1A特異性siRNA。MTT比色法分析Rab1A對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響；采用流式細胞儀分析對細胞周期和細胞凋亡的影響；Western blot觀察Rab1A siRNA對Cyclind1、GRP78、Bcl-2和Bax表達的影響。結果與陰性對照組相比，Rab1A siRNA組HeLa細胞的Rab1AmRNA和蛋白的表達均顯著下調；Rab1A siRNA抑制宮頸癌HeLa細胞增殖；與陰性對照組相比，Rab1A siRNA組HeLa細胞的S期細胞數量顯著減少（P＜0.05），G1/G0期細胞數量顯著增加（P ＜0.05），Rab1A siRNA組HeLa細胞的早期凋亡和晚期凋亡顯著增加（P＜0.01）；Rab1A siRNA組與陰性對照組相比，Cyclind1和Bcl-2在蛋白水平的表達顯著下調（P＜0.01），GRP78和Bax在蛋白水平的表達顯著上調（P＜0.01）。結論Rab1A通過調控Cyclind1的表達促進宮頸癌HeLa細胞增殖，通過調控GRP78、Bcl-2和Bax表達抑制細胞凋亡。

Rab1A；宮頸癌；HeLa細胞；細胞增殖；細胞周期；細胞凋亡

宮頸癌是世界范圍內最常見的女性生殖系統惡性腫瘤之一，其發生發展是多因素綜合作用的結果，涉及細胞生長發育、分化、衰老、凋亡、以及基因改變等復雜過程［1］。目前，傳統治療方法如手術切除、化學治療、放射治療等的治療效果仍不盡人意。宮頸癌的發生涉及癌基因/抑癌基因的異常激活/雜合性丟失、免疫改變、表觀遺傳學改變等，是一個復雜的多因素、多階段網絡調控過程。因此，從分子水平闡述宮頸癌的發病機制，將為宮頸癌的治療提供理論依據和新的分子靶標。

癌變細胞的功能障礙在一定程度上可能與囊泡運輸系統失常、蛋白質無法到達目的地有關。因此，囊泡運輸調節者Rab家族在腫瘤發生發展過程中扮演著非常重要的角色。Culine等［2］研究發現，在大多數實體腫瘤患者的血液中Rab2蛋白過量表達，并且隨著治療過程的進展，這種過量表達逐步得到改變。這為Rab蛋白參與腫瘤疾病的免疫提供了證據。劉芳莉等［3］研究發現，Rab5A在具有高轉移潛能的人肺腺癌細胞系Anip973中高表達，在低轉移潛能的母系AGZY83-a中低表達，且在非小細胞肺癌的轉移過程中涉及到RabsA基因的調控改變。近年來的研究發現，Rab1A與直腸癌等腫瘤細胞的增殖密切相關［4，5］。然而Rab1A與宮頸癌的關系尚未報道。本研究應用siRNA沉默Rab1A基因表達，分析對人宮頸癌HeLa細胞增殖的影響，觀察細胞周期調節蛋白Cyclind1表達的變化，探討Rab1A促進宮頸癌細胞增殖的分子機制。

1　材料與方法

1.1細胞株及主要試劑

人宮頸癌細胞系HeLa由西安交通大學第二附屬醫院生物醫學研究實驗中心保存。新生小牛血清與RPMI1640培養基均購自美國Gibico公司；MTT、RnaseA、胰蛋白酶、碘化丙啶（PI）購于美國Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒購于美國BD Bio-Science公司；Lipofectamine2000和Trizol購自美國Invitogen公司；逆轉錄試劑盒與qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗人Rab1A單克隆抗體、兔抗人GRP78單克隆抗體、兔抗人Cyclind1多克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體、小鼠抗人β-Actin單克隆抗體均購于美國Cell Signaling公司；RIPA裂解液購于碧云天公司；ECL化學發光試劑盒購于美國Pierce公司。

1.2細胞培養

宮頸癌HeLa細胞培養于含10%新生牛血清、100 U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養。

1.3siRNA轉染HeLa細胞

Rab1A siRNA sense:5'-GGAAACCAGUGCUAAGAAUTT-3'，antisense:5'-AUUCUUAGCACUGGUUUCCTT-3'；negative siRNA（NC-siRNA，sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，antisense:5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；由上海吉瑪公司設計、合成。將HeLa細胞分為空白對照組、陰性對照組和Rab1A siRNA組，空白對照組不做處理，陰性對照組轉染陰性對照siRNA，Rab1A siRNA組轉染Rab1A特異性siRNA。根據LipofectamineTM2000轉染試劑說明書操作，將HeLa細胞用無抗生素含血清的RPMI1640培養液重懸，接種于96或6孔板中，置37℃孵箱中培養。將siRNA瞬時轉染HeLa細胞，在無血清、無抗生素的培養液培養4-6h，換新鮮的含10%血清的RPMI1640完全培養基，繼續培養24，48，72h分別檢測細胞增殖、細胞周期和凋亡。

1.4MTT比色法檢測Rab1A siRNA對HeLa細胞增殖的影響

HeLa細胞以1×105個/ml接種于96孔培養板，每孔200μl，次日進行轉染。實驗分為陰性對照組（NC-siRNA 60nmol/L）和MeCP2 siRNA（60nmol/L）組。每組均為5個復孔，轉染后再培養24，48，72h，每孔加入5mg/mlmTT溶液20μl，37℃、5%CO2繼續培養4h，棄上清，每孔加入150μldMSO，震蕩5min，在POLARstar+OPTIMA微板測試儀上檢測光吸收值，檢測波長為492nm。

尿素市場依舊高報低走，下游成交跟進氛圍較差，商家謹慎采銷。局部裝置依舊處于輪流檢修或轉產液氨，現貨供應量微降。農業剛需清淡，下游工業隨行就市。預計近期市場震蕩微調為主，重點關注新單采購流向及裝置變化。

1.5流式細胞儀檢測Rab1A siRNA對HeLa細胞周期的影響

轉染48h時收集HeLa細胞，用預冷PBS洗滌2次。用250μl PBS重懸細胞，緩慢加入750μl無水乙醇，其終濃度為75%，4℃過夜固定；用PBS洗滌1次；再加入0.3ml濃度為100μg/ml的RnaseA（無DNase）重懸細胞；加入0.3ml濃度為100μg/ml PI染液，混合均勻，室溫避光孵育15min；用流式細胞儀（FACS）檢測，其激發波長為488nm，PI的紅色熒光通過630nm的濾光片收集，用BD FACSort Cellquect軟件獲取數據，用Modfit LT軟件來分析DNA含量。

1.6流式細胞儀檢測Rab1A siRNA對HeLa細胞凋亡的影響

收集轉染48h的HeLa細胞，制成單細胞懸液，PBS洗滌2次。用300μl結合緩沖液懸浮細胞。加100μl的細胞懸液入5ml流式管中，分別加入5μ1 AnnexinⅤ/FITC和5μl 20μg/ml的碘化丙錠，混合均勻，室溫避光孵育15min。在流式管中加入400μl PBS。用流式細胞儀檢測，光源為488nm氬離子激光器，FITC受激發后發綠色熒光，PI發紅色熒光，結果用隨機軟件進行分析。

1.7real time PCR檢測轉染Rab1A siRNA時HeLa細胞中Rab1AmRNA變化

在轉染48h的細胞中加入適當Trizol裂解細胞。用氯仿、異丙醇、75%的乙醇提取總RNA。逆轉錄，用總RNA 2.0μg，oligo（dT）18 1μl（0.5μg），5×Buffer 4μl，10mmol/LdNTP 2μl，RNasin 0.5 μl，補去離子水至18μl，M-MuLV 2μl。37℃，90min；70℃，10min；終止反應。依據人HeLa細胞MeCP2序列，設計real time PCR引物。Rab1A上游引物:5'-GGGAAAACAATCAAGCTTCAAA-3'，Rab1A下游引物:5'-CTGGAGGTGATTGTTCGAAAT-3'；β-actin上游引物:5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，β-actin下游引物:5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。real time PCR擴增條件:94℃變性2min，按94℃30 s，60℃30 s，72℃60 s×30個循環，于72℃延伸10min。用2-ΔΔCt法對real time PCR的結果相對定量分析，2-ΔΔCt表示干擾組相對于陰性對照組的擴增倍數。

1.8免疫蛋白印跡分析沉默Rab1A對Cyclind1、GRP78表達和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響

收集轉染48h的細胞，加入RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白。變性后取50μg蛋白，在10%十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后，濕轉至PVDF膜上，按照分子量大小切取條帶，用10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉1h，分別加入Rab1A兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、GRP78兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Cyclind1兔多克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Bcl-2兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、Bax兔單克隆抗體（1∶1 000稀釋）、β-actin鼠單克隆抗體（1∶3 000稀釋），在4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，10min/次。用HRP標記的羊抗兔/羊抗鼠二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育4h，TBST洗膜3次，10min/次。加入免疫印跡化學發光劑，在Syngeneg Box凝膠成像儀中拍照。應用英國SYNGENE公司的GeneTools軟件分析，計算條帶的積分光密度（opticdensity，OD）值，進行半定量分析。

采用SPSS16.0統計軟件，用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行統計學分析，各組實驗數據均以均數±標準差（ˉx±s）表示，應用GraphPad Prism 5軟件繪圖。以P＜0.05表示差異有統計學意義。實驗均重復3次。

2　結果

2.1轉染Rab1A siRNA后HeLa細胞中Rab1A表達下調

在宮頸癌HeLa細胞中穩定轉染Rab1A siRNA后，與陰性對照組相比，siRNA干擾組Rab1AmRNA表達量減少為（28.2±4.1）%，差異有統計學意義（P＜0.01，見圖1A），而陰性對照組與空白對照組相比無顯著性差異；同時，siRNA干擾組Rab1A蛋白表達與陰性對照組相比也顯著下調（P ＜0.01，見圖1B，C）。說明siRNA有效的沉默了Rab1A表達。

圖1　轉染Rab1A siRNA后HeLa細胞中Rab1A表達的變化Figure1　The changes ofrab1A expression inheLa cells after transfected withrab1A siRNA

2.2沉默Rab1A對HeLa細胞增殖的影響

應用MTT比色法分析了沉默Rab1A表達24，48，72h對宮頸癌時對宮頸癌HeLa細胞增殖活力的影響。與陰性對照相比，沉默Rab1A 48，72h均顯著降低了HeLa細胞的增殖活力（P＜0.01）；沉默Rab1A 24h與陰性對照組之間無顯著差異（見圖2）；陰性對照組與空白對照組相比無顯著差異；提示沉默Rab1A表達可抑制宮頸癌HeLa細胞增殖。

2.3沉默Rab1A對HeLa細胞周期的影響

對培養的HeLa細胞轉染Rab1A siRNA 48h，消化分散為單細胞懸液，應用流式細胞儀檢測細胞周期。沉默Rab1A組與陰性對照組相比，G0/G1期細胞數量顯著增加（P＜0.05），S期細胞數量顯著減少（P＜0.05），G2/M期細胞數量也有減少（見圖3）；而陰性對照組與空白對照組無顯著性差異，表明沉默Rab1A將宮頸癌HeLa細胞阻滯在G0/G1期，抑制細胞進入S期進行DNA復制。

圖2　MTT比色分析沉默Rab1A對HeLa細胞增殖的影響Figure2　Effectofrab1A silencing onheLa cell proliferation bymTT assay

圖3　沉默Rab1A對HeLa細胞周期的影響Figure3　Effectofrab1A silencing on cell cycle ofhe-La cells

2.4沉默Rab1A對HeLa細胞凋亡的影響

在HeLa細胞中轉染Rab1A siRNA 48h，將其消化分散為單細胞懸液，應用AnnexinⅤ+PI試劑盒染色，流式細胞儀檢測分析。陰性對照組早期凋亡細胞為（5.54±2.21）%；晚期凋亡細胞為（3.55± 1.84）%。與陰性對照組相比，沉默Rab1A組早期凋亡細胞顯著增加（P＜0.01），為（22.56±3.07）%；晚期凋亡細胞也明顯增加（P＜0.01），為（14.88± 2.62）%，陰性對照組與空白對照組相比無顯著性差異（見圖4）。

圖4　沉默Rab1A對HeLa細胞凋亡的影響Figure4　Effect ofrab1A silencing on apoptosis ofheLa cells

2.5沉默Rab1A對HeLa細胞Cyclind1、GRP78表達和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響

應用Western blot分析沉默Rab1A對宮頸癌HeLa細胞內Cyclind1表達和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響。應用Cyclind1、GRP78、Bcl-2和Bax的光密度積分值分別與內參β-actin的光密度積分值相比來表示其表達變化，達到了半定量分析的目的。結果顯示，沉默Rab1A后Cyclind1和Bcl-2表達均顯著下調（P＜0.01，見圖5A，B，D），而GRP78和Bax表達均顯著上調（P＜0.01，見圖5A，C，E），陰性對照組與空白對照組相比各蛋白無顯著變化。

3　討論

Rab1A屬于Rab家族成員，Rab家族是與蛋白囊泡運輸有關的重要效應分子，自從1983年首次發現Rab蛋白以來，目前已發現的人類Rab蛋白約70個，其主要作用和蛋白的運輸密切相關［6-8］。近年來的研究發現，Rab蛋白與某些腫瘤的發生發展密切相關［9］，例如在舌癌中的Rab1A的表達增加［10］，甲狀腺腺癌中Rab5a與Rab7的表達增加［11］，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、以及侵襲性乳腺腫瘤的Rab25的表達增加［12-14］。體外研究發現，Rab25的高表達可致使乳腺癌細胞與卵巢癌細胞的增殖活性、對外界環境的抵抗力以及抗腫瘤藥物的能力均增加，當采用siRNA沉默Rab25的表達后，上述兩種腫瘤細胞的增殖活性均明顯下降，并且凋亡增加［15］。本研究結果顯示，采用siRNA沉默Rab1A表達后，宮頸癌HeLa細胞的增殖活力顯著下降，說明了Rab1A可促進HeLa細胞增殖。

細胞周期中從G1到S期的轉換是調節細胞周期的主要節點，在細胞跨越G1/S節點后，將依照細胞周期內部的程序進行，逐漸回到G1期前［16］。M期細胞的比例大小，則表明處于增殖分裂期細胞的多少。S期細胞所占比例大小，表明開始新一輪DNA復制合成的細胞數量的多少。本研究表明，當Rab1A siRNA處理HeLa細胞后，細胞的DNA復制合成與細胞分裂顯著的減少。Cyclind1為細胞周期中G1/S轉換過程中重要的調節因子，能夠和Cdk4、Cdk6結合形成蛋白激酶復合體調控細胞跨越G1/S期節點，進入S期。本研究發現，siRNA沉默Rab1A表達后，Cyclind1的表達顯著下調。這說明Rab1A能夠調控Cyclind1的表達，使細胞跨越G1/ S期節點，進而促進宮頸癌HeLa細胞增殖。

葡萄糖調節蛋白78（glucose-regulated proteins -78，GRP78）屬于熱休克蛋白70家族成員，其在促進蛋白質加工、成熟以及維持內質網穩態中發揮重要作用［17］。多種擾亂內質網功能的刺激均能夠誘導GRP78表達。在未折疊蛋白反應過程中，GRP78的誘導表達對應激細胞抵抗凋亡和恢復正常功能具有重要的意義。本研究的結果顯示，沉默Rab1A表達，能夠促進宮頸癌HeLa細胞中GRP78表達維持內質網應激穩定。Rab25可通過調節影響Bcl-2與磷脂酰激醇3-激酶（PI-3-K）的表達，進而產生抗凋亡現象［18］。在卵巢癌上皮細胞中Rab25的過表達不僅可減少Bax蛋白和Bak蛋白的表達（它們可誘導哺乳動物細胞的凋亡），Rab25表達的減少則使Bax蛋白和Bak蛋白表達增加［19］。本研究發現，在宮頸癌中沉默Rab1A表達，則Bcl-2的表達顯著下調，而Bax的表達顯著上調，細胞凋亡增加。說明Rab1A可通過調控Bcl-2/Bax表達抑制宮頸癌細胞凋亡。

總之，Rab1A可通過上調Cyclind1的表達促進宮頸癌HeLa細胞的DNA復制與合成，導致腫瘤細胞的增殖；同時抑制了內質網應激和凋亡發生。這將有助于對宮頸癌發病機制的進一步了解，為宮頸癌的治療提供了新的分子靶點。

圖5　沉默Rab1A對Cyclind1、GRP78表達和Bcl-2/Bax凋亡通路的影響Figure5　Effect ofrab1A silencing on Cyclind1 andgRP78 expression and the Bcl-2/Bax apoptosis pathway

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Effects ofrab1A siRNA on proliferation and apoptosis of cervical cancerheLa cell line and itsmolecularmechanism

DUAN Zhao*，GONG Pijun，DU Juan，FU Lili（Department of Obstetrics andgynecology，Second Affiliatedhospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China；*Corresponding author，E-mail:duanzhao8@163.com）

Objective To investigate the effects ofrab1A on the proliferation and apoptosis of cervical cancerheLa cell line and itsmolecularmechanism.Methods The siRNA interference was used to knockdownrab1A.HeLa cells weredivided into threegroups:blankgroup，negative controlgroup andrab1A siRNAgroup.ControlsiRNA andrab1A-targeted siRNA were transfected intoheLa cells in negative controlgroup andrab1A siRNAgroup，respectively.MTT assay was used to analyze the effects ofrab1A on proliferation of cervical cancerheLa cells.The effects ofrab1A on the cell cycle and apoptosis of cervical cancerheLa cellswere observed by flowcytometry.The effects ofrab1A siRNA on the expression of Cyclind1，GRP78，Bcl-2 and Baxwere analyzed by Western blot.Resultsrab1AmRNA and protein expression significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01）.Rab1A siRNA inhibited the proliferation of cervical cancerheLa cells.The number of S phase cells significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.05），meanwhile the number ofg1/G0phase cells significantly increased（P＜0.05）.The number of early apoptotic cells and late apoptotic cells significantly increased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01）.Cyclind1 and Bcl-2 protein expression significantlydecreased inrab1A siRNAgroup compared to negative controlgroup（P＜0.01），whilegRP78 and Bax protein expressionremarkably increased（P＜0.01）.Conclusionrab1AmAy promote the proliferation of cervical cancerheLa cells throughregulating Cyclind1 expression，and inhibit the apoptosis bygRP78，Bcl-2 and Bax expression.

Rab1A；cervical cancer；Hela cell line；proliferation；cell cycle；apoptosis

R737.33

A

1007-6611（2016）04-0319-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.005

陜西省自然科學基金資助項目（2013JM4012）

段釗，男，1973-04生，博士，副主任醫師，E-mail:duanzhao8@163.com

2016-02-01