子癇前期胎盤中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究

孫　健，孫慶梅，陳　瑛，朱　芹，汪　云（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科，蘇州500；勝利石油管理局錦苑衛(wèi)生院；南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院新生兒科；共同第一作者；通訊作者，E-mail:wangyun_04@6.com）

子癇前期胎盤中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的研究

孫健1，孫慶梅2#，陳瑛3，朱芹1，汪云1*（1南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科，蘇州215002；2勝利石油管理局錦苑衛(wèi)生院；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院新生兒科；#共同第一作者；*通訊作者，E-mail:wangyun_204@126.com）

目的通過(guò)篩選及驗(yàn)證在子癇前期患者胎盤組織中差異表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），探討lncRNA與子癇前期的關(guān)系。方法收集18例子癇前期胎盤樣本和同期出生的20例正常妊娠產(chǎn)兒胎盤樣本，采用lncRNA芯片進(jìn)行研究，篩選出差異表達(dá)的lncRNA及基因，采用國(guó)際通用的基因本體（GO）功能注釋分析法和KEGG通路分析法，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋與分析，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證。結(jié)果檢測(cè)到顯著差異表達(dá)的lncRNA共有14個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有9個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有5個(gè)；檢測(cè)到顯著差異表達(dá)基因212個(gè)，表達(dá)上調(diào)的93個(gè)，表達(dá)下調(diào)的119個(gè)。對(duì)212個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO功能注釋分析，顯示差異表達(dá)基因主要參與染色質(zhì)結(jié)合、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的活性和SMAD結(jié)合等信號(hào)途徑；KEGG通路分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)的基因包括細(xì)胞周期相關(guān)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)、全身性紅斑狼瘡相關(guān)等與信號(hào)通路相關(guān)的作用基因。對(duì)顯著差異表達(dá)的3個(gè)lncRNA:linc-ASCL1-3、linc-KLF6-2和linc-ROBO1-3進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其結(jié)果與lncRNA芯片檢測(cè)結(jié)果相符。結(jié)論子癇前期的胎盤組織與正常胎盤組織相比，lncRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化，可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。

子癇前期；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；芯片

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，通常發(fā)生在妊娠20周以后，以高血壓和蛋白尿癥狀為主要特征，全世界的發(fā)病率約為2%-8%，到目前為止最有效的治療仍是終止妊娠［1-3］。胎盤是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，PE患者癥狀及其并發(fā)癥在分娩結(jié)束后往往能夠得到明顯的緩解［4］。前期研究表明，子癇前期患者及正常妊娠者胎盤組織的基因表達(dá)和表觀遺傳有明顯差異［5］，然而子癇前期相關(guān)的表觀遺傳機(jī)制仍未完全闡明。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是在真核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄形成、沒(méi)有長(zhǎng)閱讀框架、但往往具有mRNA結(jié)構(gòu)特征的RNA［6］。lncRNA可在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)，目前l(fā)ncRNA在子癇前期中的表達(dá)和功能還鮮有報(bào)道。為此，本研究應(yīng)用lncRNA芯片技術(shù)檢測(cè)子癇前期患者胎盤及正常孕產(chǎn)婦胎盤組織lncRNA和mRNA表達(dá)譜的差異，并初步篩選出與子癇前期相關(guān)的lncRNA，旨在探討lncRNA在子癇前期發(fā)生中的作用。

1　資料與方法

1.1資料來(lái)源與分組

選擇2014-02～2015-03在南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院產(chǎn)科常規(guī)產(chǎn)前檢查并確診為子癇前期的孕婦18例為病例組，參照樂(lè)杰主編的第7版《婦產(chǎn)科學(xué)》子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期18-45歲的單胎健康孕婦20例為對(duì)照組。兩組均為單胎妊娠，年齡18-45歲的初產(chǎn)婦或經(jīng)產(chǎn)婦，排除原發(fā)性高血壓、腎病、糖尿病、心臟病、前置胎盤等內(nèi)外科疾病及其他產(chǎn)科并發(fā)癥，兩組孕婦詳細(xì)情況見(jiàn)表1。所有孕婦均已簽署知情同意書(shū)，課題的研究方案通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1　兩組孕婦及其新生兒一般情況比較（ˉx±s）Table1　Com parison ofgeneraldata of pregnan twomen and neonates between twogroups（ˉx±s）

1.2胎盤樣本采集

標(biāo)本采集于胎盤娩出后5min內(nèi)迅速完成。于胎盤母體面，避開(kāi)鈣化點(diǎn)，在胎盤的不同區(qū)域剪取數(shù)塊胎盤組織，每塊約1cm×1cm，經(jīng)DEPC（焦碳酸二乙酯）處理過(guò)的PBS漂洗2次，在濾紙上去除水分后分裝于凍存管內(nèi)，標(biāo)記清楚后迅速置于液氮中速凍，轉(zhuǎn)入-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3芯片的選擇

采用GeneChip?Humangene 2.0 STArray（Affymetrix）lncRNA芯片，芯片覆蓋目前所有權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)的lncRNA，包含了11 086個(gè)lncRNA信息和30 654 個(gè)mRNA信息。

1.4總RNA的提取

采用總RNA抽提試劑盒（QIAGEN'srNeasy），參照生產(chǎn)商的步驟提取胎盤組織總RNA。用Nanodrop ND-1000測(cè)定RNA的濃度和純度，通過(guò)瓊脂糖甲醛變性凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，RNA中無(wú)DNA、無(wú)蛋白質(zhì)污染、無(wú)明顯降解，可用于基因芯片檢測(cè)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)。

1.5芯片操作方法

病例組中隨機(jī)選取2例，對(duì)照組中隨機(jī)選取3例進(jìn)行基因芯片分析，采用SuperScriptⅡRT試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成雙鏈互補(bǔ)DNA，BioArrayhigh YieldrNA Transcript Labeling試劑盒（Enzo）合成生物素標(biāo)記的cRNA，使用分光光度計(jì)檢測(cè)cRNA的濃度和質(zhì)量；片斷化cRNA后進(jìn)行雜交洗脫、染色，然后通過(guò)GeneChip?Scanner 3000 （Affymetrix）掃描儀對(duì)芯片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描，用Command Console Software 3.1（Affymetrix）讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Gene Spring Software 11.0（Agilent）進(jìn)行分析。

1.6qRT-PCR驗(yàn)證

從芯片篩選到的差異表達(dá)的基因中，選擇可能具有一定臨床意義的基因在所有的樣本中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。提取的總RNA通過(guò)HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用AceQ qPCR SYBR?GreenmAstermix（Vazyme）在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR。以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法比較病例組及對(duì)照組mRNA的水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)每組樣品均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，至少重復(fù)3遍。采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.7進(jìn)行分析。計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間差異采用t檢驗(yàn)（雙側(cè)），P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1lncRNA芯片結(jié)果

根據(jù)該芯片的結(jié)果，將子癇前期組和對(duì)照組的lncRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，其中1.5倍以上變化，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的lncRNA共有14個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的9個(gè)，表達(dá)下調(diào)的5個(gè)（見(jiàn)圖1）。linc-ASCL1-3是上調(diào)倍數(shù)最多的lncRNA，而linc-EMP1-1則為下調(diào)倍數(shù)最多的lncRNA（見(jiàn)表2）。

圖1　3例對(duì)照胎盤組織和2例病例胎盤組織差異表達(dá)的lncRNA聚類分析圖Figure1　Cluster analysis of 14differentially expressedgenes in placentas from 3 control placentas and 2 preeclampsia placentas

表2　基因芯片檢測(cè)到的人子癇前期胎盤差異表達(dá)lncRNATable2differentially expressed lncRNA in p lacental tissues of the preecalm psia neonatesdetected bym icroarray

2.2mRNA表達(dá)譜的芯片結(jié)果

將子癇前期組和對(duì)照組的芯片結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，1.5倍以上變化，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的mRNA共有212個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有93個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有119個(gè)，其中GPR32是上調(diào)倍數(shù)最多的mRNA，而FAM26D則為下調(diào)倍數(shù)最多的mRNA（見(jiàn)表3）。對(duì)212個(gè)差異表達(dá)基因分別進(jìn)行國(guó)際通用的基因本體（GO）功能注釋分析以及KEGG通路富集分析。

2.2.1GO功能注釋分析結(jié)果差異表達(dá)基因主要染色質(zhì)結(jié)合、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶的活性和SMAD結(jié)合的調(diào)節(jié)等信號(hào)途徑，篩選出的GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見(jiàn)表4。

2.2.2KEGG通路分析結(jié)果將差異顯著基因在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行查詢，設(shè)定P＜0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)，差異表達(dá)基因中有細(xì)胞周期相關(guān)、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)和全身性紅斑狼瘡相關(guān)等信號(hào)通路相關(guān)作用的基因，篩選出的生物學(xué)通路名稱及其基因數(shù)見(jiàn)表5。

表3　基因芯片檢測(cè)到的人子癇前期胎盤差異表達(dá)mRNATable3　differentially expressedmRNA in placental tissuesof the preecalmpsia neonatesdetected bym icroarray

表4　差異表達(dá)基因的GO功能注釋結(jié)果Table4　gO enrichm ent analysis ofdifferentially expressedgenes

表5　差異表達(dá)基因的KEGG通路及其基因數(shù)Table5　KEGG pathways andgenes number ofdifferentially expressedgenes

2.3qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因的結(jié)果

選取芯片中表達(dá)有差異的3個(gè)lncRNA:linc-ROBO1-3、linc-KLF6-2和linc-ASCL1-3進(jìn)行qRTPCR驗(yàn)證，以磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)在18例病例組胎盤和20例對(duì)照組胎盤中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，linc-ASCL1-3在病例組胎盤組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比表達(dá)上調(diào)2.72倍；而linc-ROBO1-3和linc-KLF6-2在病例組中的表達(dá)水平低于對(duì)照組，與對(duì)照組相比分別表達(dá)下調(diào)2.21倍和11.25倍，其結(jié)果與基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果基本相符（見(jiàn)表6）。

表6　差異表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果（ˉx±s）Table6　Confirmation ofdifferentially expressed lncRNA byrT-PCR（ˉx±s）

3　討論

子癇前期是妊娠期特有的嚴(yán)重并發(fā)癥，可引起全身多器官功能損害以及功能的衰竭，如循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦以及圍產(chǎn)兒死亡的主要原因，一直是產(chǎn)科研究的重點(diǎn)［7］。對(duì)于子癇前期的病因有多重學(xué)說(shuō)，涉及母體、胎盤和胎兒等多種因素，包括滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)功能異常、遺傳因素和營(yíng)養(yǎng)因素等［8-10］，然而至今發(fā)病機(jī)制不明。近年來(lái)，非編碼RNA（noncodingrNA，ncRNA）的功能研究越來(lái)越引起人們的重視，許多研究表明這些非編碼RNA在調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程中扮演了關(guān)鍵的角色［11］。其中microRNA在子癇前期中的作用已經(jīng)被廣泛研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-210和miR-34a等在子癇前期的發(fā)生中有重要作用［12-14］。近年來(lái)的研究表明，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過(guò)程。哺乳動(dòng)物基因組序列中4%-9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA，而相應(yīng)的參與蛋白編碼RNA的比例是1%。lncRNA的異?？梢詫?dǎo)致多種疾病，越來(lái)越多的證據(jù)顯示lncRNA在子癇前期的發(fā)生中也發(fā)揮了重要作用，然而對(duì)子癇前期中l(wèi)ncRNA的研究很少，僅有一篇關(guān)于子癇前期胎盤lncRNA表達(dá)譜的報(bào)道［15］，其中LOC391533，LOC284100，CEACAMP8在子癇前期樣本中高表達(dá)。另外Zou等［16］報(bào)道，lncRNA SPRY4-IT1在子癇前期胎盤中表達(dá)顯著降低，并且在胎盤滋養(yǎng)層HTR-8/SVneo細(xì)胞系中SPRY4-IT1的過(guò)表達(dá)顯著降低了細(xì)胞的遷移和增殖，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡，首次在細(xì)胞水平中證明了lncRNA在子癇前期的作用。又有文章闡明lncRNAmALAT-1在子癇前期胎盤中表達(dá)顯著降低，在JEG-3細(xì)胞中促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡［17］，下調(diào)lncRNAmEG3的表達(dá)可以抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移，并且引起細(xì)胞的凋亡［18］。

本研究通過(guò)lncRNA芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)子癇前期胎盤中差異表達(dá)的lncRNA共14個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的9個(gè)，表達(dá)下調(diào)的5個(gè)；差異表達(dá)的mRNA 212個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)的有93個(gè)，表達(dá)下調(diào)的有119個(gè)。擴(kuò)大樣本量對(duì)linc-ASCL1-3、linc-KLF6-2和linc-ROBO1-3進(jìn)行了qRT-PCR檢測(cè)，其結(jié)果與基因芯片技術(shù)檢測(cè)結(jié)果相符。linc-KLF6-2全長(zhǎng)43 129bp，位于10號(hào)染色體（4242829-4285957，“-”鏈）包含2個(gè)外顯子；linc-ASCL1-3全長(zhǎng)2 586bp，位于12號(hào)染色體（102707354-102709939；“+”鏈）包含2個(gè)外顯子；linc-ROBO1-3全長(zhǎng)9 169bp，位于3號(hào)染色體（80810391-80819559，“-”鏈）包含3個(gè)外顯子，但是關(guān)于它們的功能以及在子癇前期中的作用還需要進(jìn)一步的研究。

子癇前期胎盤中差異表達(dá)的mRNA共212個(gè)，其中GPR32是上調(diào)倍數(shù)最多的mRNA，而FAM26D則為下調(diào)倍數(shù)最多的mRNA。GO功能注釋結(jié)果表明，染色質(zhì)結(jié)合相關(guān)的基因差異表達(dá)最明顯，主要有CENPA，SOX2，CDCA5，TOP2A，SUV39H2。KEGG通路分析結(jié)果表明，細(xì)胞周期相關(guān)基因差異表達(dá)最明顯，主要有CCNB1，CCNB2，PLK1，DBF4，CHEK1，CDC20。lncRNA在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)節(jié)的多個(gè)水平發(fā)揮作用，有研究證實(shí)lncRNA通過(guò)與特異性靶點(diǎn)mRNA的堿基配對(duì)可以促進(jìn)mRNA的降解，從而改變mRNA的水平［19］。而在子癇前期中l(wèi)ncRNA的差異表達(dá)如何影響相關(guān)的mRNA水平，從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生還需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為子癇前期患者的胎盤組織與正常孕婦胎盤組織相比，lncRNA表達(dá)譜發(fā)生了顯著變化，這些lncRNAs可能與子癇前期的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而這些lncRNAs是否可以成為預(yù)測(cè)的標(biāo)記物或者治療的靶點(diǎn)，還需要進(jìn)一步功能的研究。

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Investigation on thedifferentially expressed long non-codingrNAs in preeclampsia placenta

SUN Jian1，SUN Qingmei2#，CHEN Ying3，ZHUQin1，WANGYun1*（1department ofObstetrics，Nanjingmedical University Affiliated Suzhouhospital，Suzhou 215002，China；2Jinhuahealth-center of Shengli Petroleum Administration；3department of Neonatology，Nanjingmedical University Affiliated Suzhouhospital；#Co-first author；*Corresponding author，E-mail:wangyun_204@126.com）

Objective Toexplore therelationship between lncRNAs and preeclampsia through screening andValidating thedifferentially expressed long non-codingrNA（lncRNA）in preeclampsia placenta.Methods The lncRNA andgene expression profilesweredetected in 18 preeclampsia placentas and 20 normal placentas by Affymetrixmicroarray.Gene ontology（GO）enrichment analysis and KEGG pathway analysiswere carried out to screen thegenes and pathwaysrelated to preeclampsia.Differentially expressed lncRNAs were further confirmed by quantitativereal-time PCR（qRT-PCR）.Results A total of 14 lncRNAs weredifferentially expressed，of which 9 were up-regulated and 5 weredown-regulated.And 212genesweredifferentially expressed，ofwhich 93 were up-regulated and 119 weredown-regulated.GO enrichment analysis of the 212genes indicated that thedifferentially expressedgenes wererelated to chromatin binding，gamma-glutamyltransferaseactivity and SMAD binding，etc，and KEGG pathway analysisshowed that thedifferentially expressedgeneswere involved in cell cycle，comp lement and coagulation cascades and systemic lupus erythematosus pathway，etc. Significantlydifferentially expressed lncRNAs，linc-ASCL1-3，linc-KLF6-2 and linc-ROBO1-3 were chosen for further confirmation by qRT-PCR，and theresultswere consistentwith that ofmicroarray.Conclusion Compared with normal controls，lncRNAs profiles in preeclampsia placenta aredifferentially expressed，which indicate that thesedifferentially expressed lncRNAsmight play arole in thedevelopment of preeclampsia.

preeclampsia；long non-codingrNA；microarray

R714.24

A

1007-6611（2016）04-0333-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.008

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20131151）；蘇州市臨床診療技術(shù)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（LCZX201308）；蘇州市臨床醫(yī)學(xué)中心（SZZX201505）；蘇州市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（SYS2015104，SYS201568）；蘇州市科教興衛(wèi)資助項(xiàng)目（KJXW2015022）

孫健，男，1983-10生，碩士，助理研究員，E-mail:sunjiangoal@163.com

2016-01-20