雙水相萃取的葛根黃酮搽劑對神經根型頸椎病大鼠的療效

梁云星，鄭　穎，王　寧，郭小紅，梁桂賢（山西醫科大學藥學院，太原03000；山西醫科大學病理教研室；通訊作者，E-mail:lgx6630@sina.com）

雙水相萃取的葛根黃酮搽劑對神經根型頸椎病大鼠的療效

梁云星1，鄭穎1，王寧1，郭小紅2，梁桂賢1*（1山西醫科大學藥學院，太原030001；2山西醫科大學病理教研室；*通訊作者，E-mail:lgx6630@sina.com）

目的考察基于聚合物雙水相萃取技術所得葛根黃酮搽劑對神經根型頸椎病大鼠的療效。方法采用椎管插線法建立神經根型頸椎病大鼠模型，隨機分為搽劑高、中、低劑量外用給藥組、陽性對照組和模型組共5組，通過行為學和病理形態學考察藥物的作用。結果造模后，大鼠術側前肢彎曲，五趾緊縮，落地即抬起。給藥10d后，模型組大鼠癥狀無明顯改變；葛根黃酮搽劑中、高劑量組和陽性對照組自發痛值、步態評分值降低，游泳時間增長，與模型組相比差異有統計學意義（P ＜0.05），受損神經根出現空泡樣變、壞死灶和軸突扭曲癥狀減輕。結論葛根黃酮搽劑能有效減輕神經根型頸椎病大鼠的神經根性疼痛，改善受損神經根狀態。

葛根黃酮；雙水相萃取；神經根型頸椎病

頸椎病是臨床常見疾病，表現為局部頸肩疼痛、神經根性病變、脊髓病變等［1］。根據臨床癥狀不同，可分為5種類型，其中神經根型頸椎病（cervical spondyloticradiculopathy，CSR）最為常見。目前認為CSR是由于頸椎椎管退變或神經根受到壓迫等因素誘發所支配區域出現一定程度的疼痛、麻木、感覺缺失或變化，臨床主要表現為肩臂的疼痛、麻木，無力等［2］。葛根對于頸椎病的治療已有廣泛的研究。《傷寒論》中有記載:“太陽病，項背強幾幾，無汗惡風，葛根湯主之”，“太陽病，項背強幾幾，反汗出惡風者，桂枝加葛根湯主之”［3］。現代藥理研究表明，葛根具有抑制炎癥介質活性、保護神經細胞、改善微循環、擴張血管、改善骨代謝等藥理作用［4］。目前國內葛根用于治療頸椎病只限于口服給藥，但是葛根素等異黃酮類成分在胃腸道吸收差，藥物達病灶部位濃度低，為了方便用藥，提高頸椎病患者頸、肩局部藥物濃度，增強療效，研究葛根黃酮外用給藥制劑有重要臨床意義。

本課題前期研究表明葛根黃酮搽劑有良好的透過性，本實驗建立神經根型頸椎病大鼠模型，將葛根黃酮搽劑局部外用給藥，通過行為學和病理形態學考察藥物對神經根型頸椎病的作用，為臨床外用給藥提供實驗依據。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

葛根黃酮搽劑（實驗室自制），頸復康顆粒（承德頸復康藥業集團有限公司），戊巴比妥鈉（美國Sigma），多聚左旋賴氨酸（北京賽因坦科技有限公司），甲醛溶液（天津市北辰方正試劑廠）。

1.2實驗動物

SD雄鼠40只，普通級，體重200-220g，購自山西醫科大學動物中心。

1.3神經根型頸椎病大鼠的建立與分組

根據竇夏睿［5］、趙偉宏［6］所述椎管插線法進行大鼠造模。術后第5天選擇25只步態評分為2-3分，無脊髓壓迫癥狀的大鼠入組。隨機編號，分為5個處理組:葛根黃酮搽劑高、中、低劑量組、陽性對照組、模型組，每組大鼠各5只。根據藥理實驗中動物和人體等效劑量轉換公式［7］，葛根黃酮搽劑高、中、低劑量組分別按葛根素含量為266.61，177.74，88.87mg/（kg·d）涂抹于大鼠患側皮膚，陽性對照組按3ml/d灌胃給予頸復康溶液，模型組在大鼠患側皮膚按3ml/d涂抹生理鹽水，連續給藥10d。

1.4自發痛評估

將大鼠放置在一個大有機玻璃箱內，待其安靜后，記錄5min內患肢離地的累積時間（s），取3次的平均值。

1.5步態評估

觀察大鼠行走及休息時的姿勢，結合Kawakami等［8］與Dubulsson等［9］法對其由疼痛攣縮造成的步態障礙進行評估:1分，正常步態、足無畸形；2分，受損傷足輕觸玻璃臺面，不持重或輕微持重，走時跛行、足內收蜷縮畸形；3分，受損足抬起蜷縮，走動時不著臺面。

1.6游泳時間測定

將大鼠置于水溫為（43±0.5）℃且水位足夠淹沒其整個身體的恒溫水槽中，記錄大鼠從入水到自然下沉的時間，做為大鼠的游泳時間。

1.7組織病理學觀察

實驗結束后，水合氯醛麻醉致死大鼠，迅速取出壓線段脊髓、神經根及附近組織，10%甲醛溶液固定24h。完整剝離脊髓及神經根，常規石蠟包埋，切3-4μm縱切片或橫切片，HE染色。在光鏡下觀察神經根及脊髓形態。

1.8統計學分析

數據用均數±標準差（ˉx±s）描述，SPSS16.0進行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異使用LSD-t檢驗。

2　結果

2.1行為學評價

造模后大鼠體重均無明顯減輕，傷口愈合良好，無自噬及舔咬，無膿性分泌物。術側前肢彎曲，五趾緊縮，活動明顯受限，不能持重或落地即抬起，走路微跛，觸碰時躲避并嘶叫。實驗結束時，模型組大鼠癥狀無明顯改變；葛根黃酮搽劑中、高劑量組和陽性對照組相關行為顯著減輕，四肢趨于平等持重。

2.2自發痛比較

由表1可知，大鼠治療后自發痛值均有所下降，且各組治療前后差值存在顯著差異（P=0.013）。在α=0.05水準上進行組間LSD-t檢驗:高劑量組和模型組治療后自發痛值差異有統計學意義（P= 0.043），尚不能認為其他組與模型組之間存在統計學差異（P＞0.05）；葛根黃酮中劑量組、高劑量組和陽性對照組治療前后自發痛差值與模型組相比差異有統計學意義（P值分別為0.022，0.002和0.022）；高劑量組治療前后差值與低劑量組相比差異有統計學意義（P=0.01），尚不能認為其他劑量組之間存在統計學差異；尚不能認為陽性對照組和葛根黃酮高、中、低劑量組之間存在統計學差異。

表1　各組自發痛評分比較（s，n=5）Table1　Comparison of spontaneous painValue betweengroups（s，n=5）

2.3步態評分比較

由表2可知，大鼠治療后步態評分均有所下降，各組治療后以及治療前后差值均有顯著性差異（P分別為0.026，0.07）。鑒于步態評分值范圍較小，故在α=0.1水準上進行組間LSD-t檢驗:高劑量組和陽性對照組治療后步態評分與模型組相比差異有統計學意義（P分別為0.003和0.02）；高劑量組和低劑量組治療后步態評分差異有統計學意義（P= 0.02），尚不能認為其他劑量組間有統計學差異；葛根黃酮中劑量組、高劑量組和陽性對照組治療前后差值與模型組相比有統計學差異（P分別為0.072，0.021和0.072）；低劑量組和高劑量組治療前后差值有統計學差異（P=0.072），尚不能認為其他劑量組之間差值差異有統計學意義；尚不能認為陽性對照組和葛根黃酮高、中、低劑量組之間有統計學差異。

表2　各組步態評分比較（分，n=5）Table2　Comparison ofgait score betweengroups （score，n=5）

2.4游泳時間比較

由表3可知，大鼠治療后游泳時間增長，且各組治療后及治療前后差值均有顯著性差異（P分別為0.03和0.005）。在α=0.05水準上進行組間LSD-t檢驗:葛根黃酮高劑量組和模型組治療后游泳時間差異有統計學意義（P=0.005），尚不能認為其他治療組與模型組間差異存在統計學意義（P＞0.05）；低劑量組和高劑量組治療后及治療前后差值均存在統計學差異（P分別為0.005和0.002）；中劑量組、高劑量組、陽性對照組與模型組相比治療前后差值有顯著性差異（P值分別為0.029，0.002 和0.029）；尚不能認為陽性對照組和葛根黃酮高、中、低劑量組間存在統計學差異。

表3　各組游泳時間比較（s，n=5）Table3　Com parison of swimm ing time betweengroups （s，n=5）

2.5組織病理學變化

光鏡下觀察，可見模型組大鼠患側微血管擴張充血，軸突扭曲，部分髓鞘呈空泡樣改變；神經元出現可逆性空泡樣改變，胞體增大，胞質淡染，甚至有些細胞核固縮、碎裂，溶解消失形成不可逆性空洞狀壞死灶，病變較為嚴重，周圍環繞衛星細胞，但炎細胞浸潤不明顯。與模型組相比，葛根黃酮搽劑高劑量組和陽性對照組部分胞體增大，胞質淡染，但核仁基本還在，出現空泡樣變、壞死灶和軸突扭曲數量減少（見圖1，2）。

圖1　大鼠受損神經根病理表現（HE染色，×200）Figure1　The pathological changes of injured nerveroot byhE staining（×200）

3　討論

神經根型頸椎病的造模方法很多，包括動靜力失衡法、椎管前路置入螺釘、甲醛定量濾紙片法等，但都存在造模時間長，對動物損害大，不容易操作等缺點。本實驗采用椎管插線法，對大鼠頸部背根神經造成持續卡壓，通過控制漁線直徑確定壓迫程度，定位準確，損傷較小，且造模迅速。

本實驗結果表明:高劑量的葛根黃酮搽劑能有效減輕神經根型頸椎病神經根性疼痛、改善受損神經根狀態。且高劑量與低劑量組間差異顯著，說明增大葛根黃酮搽劑的局部用量，可以使藥物更有效地發揮作用。對于葛根治療頸椎病的機制，已有報道指出:葛根四蟲湯具有抗炎、鎮痛、改善微循環及血液流變學的作用［10］；潘洪平等［11］研究表明葛根素可以減輕缺血性大鼠腦細胞的損傷，提高其熱休克蛋白70（HSP70）表達水平，從而起到保護神經細胞的作用；于林等［12］認為退變椎間盤含水量缺失，葛根素能增加椎間盤的含水量，提高椎間盤水通道蛋白1（AQP1）的表達。方月龍［13］通過實驗表明:葛根素能夠有效保護纖維環細胞，抵抗炎癥對纖維環的破壞，起到保護椎間盤，延緩椎間盤退變的作用。PGE2為促炎介質，能使痛覺傳入神經末梢對組織胺、緩激肽的反應更敏感。馬麟等［14］通過放射免疫法測得桂枝加葛根湯治療組與可降低PGE2、6-KPGFla水平，抑制炎癥介質生成。從本實驗可知葛根黃酮對神經根型頸椎病有一定療效，但通過外用給藥途徑對頸椎病的具體作用機制還有待進一步研究。

圖2　大鼠受損神經根病理變化（HE染色×400）Figure2　The pathological changes of injured nerveroot byhE staining（×400）

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Effects of pueraia flavonoids liniment based on aqueous two-phase extraction on cervical spondyloticradiculopathyrats

LIANG Yunxing1，ZHENG Ying1，WANGNing1，GUO Xiaohong2，LIANGGuixian1*（1Collegeof Pharmacy，ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China；2department of Pathology，ShanxiMedical University；*Corresponding author，E-mail:lgx6630@sina.com）

Objective To investigate the effects of pueraria flavonoids liniment based on aqueous two-phase extraction on cervical spondyloticradiculopathyrats.Methods Cervical spondyloticradiculopathyratmodelwas established by inserting the nylon thread to spinal canal.Therats wererandomized into 5groups:highdosegroup，middledosegroup，lowdosegroup，positive controlgroup andmodelgroup.The effects of pueraria flavonoids linimenton behavior and pathologicalmorphology changeswere observed.Results Aftermodeling，the foreleg of operation sidewas bent，five fingerswerehuddled together，and the feet lifted as soon as touched theground. After 10dmedication，the symptomswere not improved inmodelgroup.Compared withmodelgroup，the spontaneous painValueandgait score weredecreased（P＜0.05），while the swimming timewas increased inhighdose，middledosegroup and positive controlgroup（P＜0.05）.The number of neuronVacuolardegeneration，cellular necrosis，and axondistortion were alleviated.Conclusion Pueraria flavonoids liniment couldrelieve theradicular pain of cervical spondyloticradiculopathyrats and improve thedamages of nerve.

pueraria flavonoids；aqueous two-phase extraction；cervical spondyloticradiculopathy

R681.55

A

1007-6611（2016）04-0315-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.004

梁云星，女，1989-03生，在讀碩士，E-mail:594597834@qq.com

2016-01-20