N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過上調(diào)Bak和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡

楊高祥，周　妍，田　華，吳　巍（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069；通訊作者，E-mail:weiwu207@ccmu.edu.cn）

N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過上調(diào)Bak和下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡

楊高祥，周妍，田華，吳巍*（首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069；*通訊作者，E-mail:weiwu207@ccmu.edu.cn）

目的探究N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素（D，L-sulforaphane N-Acetyl-L-cysteine，SFN-NAC）誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機制。方法將前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3分別培養(yǎng)在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時，分別隨機分為對照組（不加SFN-NAC）和加藥組（加入終濃度為30μmol/L的SFN-NAC），繼續(xù)在37℃培養(yǎng)24h。利用AnnexinⅤ異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（FITC/PI）雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡程度；利用Western blot檢測Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組相比，加藥組的細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.01）。加藥組細(xì)胞Bak蛋白表達(dá)較對照組升高（P＜0.05）；Bax蛋白表達(dá)也有少量增加，但與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；Bcl-2蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；Bax/Bcl-2比值增加（P＜0.01）；細(xì)胞cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高（P＜0.01）。結(jié)論N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過上調(diào)Bak、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，活化Caspase-3，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，說明N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素通過線粒體途徑發(fā)揮抗癌作用。關(guān)鍵詞：N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素；前列腺癌；Bak；Bax/Bcl-2；凋亡

近年來，隨著人口老齡化的不斷加劇以及生活方式的改變，我國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，前列腺癌正在成為威脅我國男性健康的惡性腫瘤［1］。目前國際上尚無理想的治療前列腺癌的藥物，因此研發(fā)有效治療前列腺癌的藥物十分迫切。

近年許多研究表明，食用十字花科類蔬菜有降低前列腺癌發(fā)病率及惡化的可能性［2，3］。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）是從十字花科植物中提取的一種抗癌物質(zhì)，在人體內(nèi)通過硫醚氨酸途徑（mercapturic acid pathway）代謝，最終在尿液中以N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素形式存在［4］。用SFN-NAC或PEITC-NAC處理前列腺癌細(xì)胞LNCaP，能夠抑制細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5，6］；在用PC-3構(gòu)造的前列腺癌小鼠模型中，連續(xù)用8μmol/g PEITC-NAC喂養(yǎng)小鼠9周，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積減小了50%［7］。這些研究都說明NAC衍生物也具有抗癌活性，也能引起細(xì)胞凋亡，但引起凋亡的分子機制尚不清楚。本研究將對SFN-NAC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機制進(jìn)行探究，為抗腫瘤新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株、主要試劑

人前列腺癌細(xì)胞株DU145和PC-3購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone，胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡試劑盒（FAK012.20）購自欣博盛生物科技有限公司。Bak、Bax和Bcl-2抗體購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SFN-NAC、cleaved Caspase-3 和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理

培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3的完全培養(yǎng)基是含有10%胎牛血清的RPMI1640，培養(yǎng)溫度37℃，CO2濃度為5%。將DU145和PC-3接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時，認(rèn)為細(xì)胞處于對數(shù)生長期，可用于藥物干預(yù)實驗。

給處于對數(shù)生長期的細(xì)胞換液，并隨機分為對照組和加藥組。對照組組不加SFN-NAC，加藥組則加入終濃度為30μmol/L的SFN-NAC。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后用FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，用Western blot檢測Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.3FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

操作方法嚴(yán)格按照使用說明書:用不含EDTA的胰酶收集細(xì)胞，然后用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入250μl 1×結(jié)合緩沖液，混勻后取195μl細(xì)胞懸液，加入5μl FITC室溫染色3min，然后加入10μl PI避光染色10min，加入300μl1×結(jié)合緩沖液，搖勻，上機檢測。其中FITC+/PI-為早期凋亡細(xì)胞。

1.4Western blot檢測Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

［8］實驗方法。收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA測定濃度后，用SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜并封閉。加一抗在4℃搖床上過夜孵育，然后加二抗室溫孵育1h。用Odyssey紅外成像儀掃描并儲存圖片。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，兩兩比較采用非配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1FITC/PI雙染法檢測SFN-NAC誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

為了探究SFN-NAC能否誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡，本研究用FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與對照組相比較，加藥組細(xì)胞凋亡率增高（見圖1）。其中DU145細(xì)胞的對照組與加藥組細(xì)胞凋亡率分別為（2.7±0.06）%和（5.7±0.64）%，加藥組的細(xì)胞凋亡率是對照組細(xì)胞凋亡率的大約2倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。PC-3細(xì)胞的對照組與加藥組細(xì)胞凋亡率分別為（1.6±0.34）%和（4.8 ±0.29）%，加藥組的細(xì)胞凋亡率是對照組細(xì)胞凋亡率的大約3倍，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1　SFN-NAC處理24h后DU145和PC-3細(xì)胞的凋亡程度Figure1　Apoptosis ofdU145 and PC-3 after exposed to SFN-NAC for 24h

2.2SFN-NAC處理對細(xì)胞內(nèi)Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)影響

為了闡明SFN-NAC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的分子機制，本研究檢測促凋亡蛋白Bak，Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2，以及其下游活化的Caspase-3的表達(dá)情況，結(jié)果見圖2，3。與對照組相比，加藥組細(xì)胞內(nèi)的促凋亡蛋白Bak表達(dá)升高（P＜0.05）；加藥組的Bax蛋白表達(dá)也有少量增加，但與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；加藥組的抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而加藥組細(xì)胞內(nèi)的cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)上升，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3SFN-NAC誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值升高

DU145細(xì)胞的對照組與加藥組的Bax/Bcl-2比值分別為3.18±0.13和8.52±0.85，PC-3細(xì)胞的對照組與加藥組的Bax/Bcl-2比值分別為3.17± 0.08和11.2±0.54。與對照組相比，加藥組細(xì)胞的Bax/Bcl-2比值升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，見圖4）。

圖2　SFN-NAC處理24h后DU145細(xì)胞Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表達(dá)變化Figure2　Expression of Bak，Bax，Bcl-2 and cleaved Caspase-3 indU145 cells after exposed to SFN-NAC for 24h

圖3　SFN-NAC處理24h后PC-3細(xì)胞Bak、Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的表達(dá)變化Figure3　Expression of Bak，Bax，Bcl-2 and cleaved Caspase-3 in PC-3 cells after exposed to SFN-NAC for 24h

圖4　SFN-NAC處理24h后DU145和PC-3細(xì)胞Bax/Bcl-2比值變化Figure4　Bax/Bcl-2ratio indU145 and PC-3 cells after treated with SFN-NAC for 24h

3　討論

野生型SFN具有抗癌活性，通過上調(diào)Cyclin A、 B1的表達(dá)，下調(diào)Cyclind1、Cdk4、Cdc25C，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯［9］；也有研究表明，SFN能抑制組蛋白去乙酰化酶活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］。SFN多靶點抗癌機制已成為人們研究的熱點，但對其衍生物N-乙酰半胱氨酸蘿卜硫素的抗癌機制國際上報道較少。本研究通過流式細(xì)胞技術(shù)分析表明，SFNNAC能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3凋亡，這說明SFN-NAC和SFN一樣，都具有抗癌活性。但與SFN相比，SFN-NAC有兩個明顯的優(yōu)點［11］:①具有更低的辛辣味，可以減少對黏膜的刺激，有利于人體對藥物的吸收。②具有更高的安全性:A/J小鼠對于SFN-NAC的最大耐受濃度比野生型SFN的最大耐受濃度高出兩倍多。另外，SFN-NAC在體內(nèi)存在時間更長［12］，這也將有利于藥物活性的發(fā)揮。

本實驗還探究了SFN-NAC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機制。細(xì)胞凋亡的分子機制主要包括外源性途徑（extrinsic orreceptor-mediated pathway）和內(nèi)源性途徑（intrinsic ormitochondria-mediated pathway）［13］。典型的外源性途徑主要通過死亡受體和配體相互作用，激活Caspase-8，誘導(dǎo)凋亡；而內(nèi)源性途徑則主要依靠Bcl-2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性（mitochondrialmembrane permeabilization，MMP），釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-9，進(jìn)而激活Caspase-3，誘導(dǎo)凋亡。Bcl-2家族蛋白大致可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩種［14］。Bak，Bax屬于促凋亡蛋白，在SFN誘導(dǎo)凋亡過程中起重要作用［15］。Bcl-2則是抗凋亡蛋白，其與Bax的平衡在凋亡過程中同樣發(fā)揮重要作用。研究表明，Bax的編碼區(qū)含有與Bcl-2同源的BH1和BH2結(jié)構(gòu)域，Bcl-2可以通過該區(qū)域與Bax形成異源二聚體，阻止Bax自身形成二聚體或與Bak形成異源二聚體［16］。尤其是當(dāng)Bax/Bcl-2比率升高時，會導(dǎo)致內(nèi)源性途徑的凋亡發(fā)生［17］。本研究結(jié)果表明:SFN-NAC能誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞中促凋亡蛋白Bak表達(dá)，同時使Bax/ Bcl-2比率升高，進(jìn)而導(dǎo)致下游蛋白Caspase 3的活化。這是SFN-NAC誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的分子機制之一，更深入的研究正在進(jìn)行。

總之，本研究表明，蘿卜硫素類似物SFN-NAC能夠引起前列腺癌細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的機制是通過活化Caspase-3途徑，這和野生型SFN途徑誘導(dǎo)凋亡途徑類似，但是具有更長的半衰期，提示SFN-NAC是一種更有潛力的抗前列腺癌藥物。

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D，L-sulforaphane N-Acetyl-L-cysteine induces apoptosis by upregu lating Bak anddownregulating Bcl-2 inhuman prostate cancer cells

YANGgaoxiang，ZHOU Yan，TIANhua，WUWei*（Department of Biochemistry andmolecular Biology，School of Basicmedical Sciences，Capitalmedical University，Beijing 100069，China；*Corresponding author，E-mail:weiwu207@ccmu.edu.cn）

Objective To investigate themechanisms of apoptosis caused byd，L-sulforaphane N-Acetyl-L-cysteine（SFN-NAC）inhuman prostate cancer cells.Methodshuman prostate cancer cellsdU145 or PC-3 were seeded in six-well plates.When the cell confluencyreached 70%-80%，they wererandomlydivided into controlgroup（no SFN-NAC treatment）and treatmentgroup（treated with 30μmol/LSFN-NAC）.After24h incubation at37℃，the apoptosiswas assessed by FITC-AnnexinⅤ/PIstaining，the expression levels of Bak，Bax，Bcl-2 and cleaved Caspase-3 weredetected by Western blot.Results Therate of apoptosis in treatmentgroup was significantlyhigher than that in controlgroup（P＜0.01）.Compared with controlgroup，the expression of Bak significantly increased in treatmentgroup（P＜0.05），and the expression of Bax increased slightly，but there was no statisticaldifference（P＞0.05）.The expression of Bcl-2 in treatmentgroup significantlyreduced（P＜0.05），while therate of Bax/Bcl-2 and the expression of cleaved Caspase-3 were significantly increased（P＜0.01）.Conclusion SFN-NAC could induce the apoptosis by upregulating Bak anddownregulating Bcl-2 inhuman prostate cancer cells，indicating that SFN-NAC play arole in anti-cancer through them itochondriamediated pathway.

D，L-sulforaphane N-Acetyl-L-cysteine；prostate cancer；Bak；Bax/Bcl-2；apoptosis

R737.25

A

1007-6611（2016）04-0311-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.04.003

國家自然科學(xué)基金資助項目（81272843）

楊高祥，男，1989-08生，碩士，E-mail:ygx201314@163.com

2016-02-17