益骨湯含藥血清對新生大鼠成骨細胞成骨性的影響

陳　芳，劉　琴，王麗平，張　宜

(廣州軍區武漢總醫院，湖北 武漢 430070)

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益骨湯含藥血清對新生大鼠成骨細胞成骨性的影響

陳芳，劉琴，王麗平，張宜

(廣州軍區武漢總醫院，湖北 武漢 430070)

目的探討益骨湯含藥血清對新生大鼠成骨細胞增殖及其成骨分化的影響。方法實驗分為益骨湯高劑量組、益骨湯中劑量組、益骨湯低劑量組、a-D3膠丸組、空白組，先制備各組相應含藥血清，然后采用酶消化法獲得新生大鼠的成骨細胞，每組給予相應含藥血清培養成骨細胞，分別檢測各組成骨細胞增殖情況及堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣鹽沉積量、骨鈣素分泌量。結果益骨湯高、中、低劑量組和a-D3膠丸組成骨細胞增殖情況均明顯優于空白組(P均<0.05)，益骨湯高、中、低劑量組間比較差異無統計學意義；成骨細胞ALP活性、鈣鹽沉積量、骨鈣素分泌量均明顯高于空白組(P均<0.05)，而與a-D3膠丸組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。益骨湯中劑量組ALP活性、鈣鹽沉積量、鈣素分泌量均明顯高于益骨湯低劑量組。結論益骨湯含藥血清可促進成骨細胞的增殖及成骨分化。

成骨細胞；增殖分化；益骨湯；含藥血清

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以低骨量、骨組織結構退化為特征，使骨的脆性增加以及易于發生骨折的一種全身性骨骼疾病，是中老年人常見多發病之一[1]。隨著人口老齡化，骨質疏松癥已成為社會的主要健康問題之一。中藥防治骨質疏松有療效確切、不良反應少的優點。筆者前期研究初步證實，益骨湯含藥血清對成骨細胞增殖及分泌白細胞介素-6(IL-6)和胰島素樣生長因子(IGF-1)均有一定的影響[2-3]。本研究主要從益骨湯含藥血清對新生大鼠成骨細胞的增殖能力、堿性磷酸酶活(ALP)活性、鈣鹽沉積量、骨鈣素分泌量的影響，探討其防治骨質疏松癥的可能作用機制，現將結果報道如下。

1　實驗資料

1.1藥品和試劑益骨湯水煎液(由補骨脂、骨碎補、生地、仙靈威、淮山藥、丹參等組成)，湖北省中醫院藥房提供，批號：20140716；a-D3膠丸，以色列梯瓦制藥工業有限公司生產，批號：20130526；RPMI1640，Gibco公司產品，批號：8115157；CCK-8試劑盒，碧云天生物技術研究所產品，批號：C0038；堿性磷酸酶試劑盒、鈣鹽沉積量檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所產品，批號：20141016；20141126；骨鈣素ELISA試劑盒，武漢博士德生物公司產品，批號：20141120；其他試劑均為實驗室常備國產分析純試劑。

1.2實驗動物新生Wistar大鼠10只，分離原代成骨細胞；12周齡Wistar大鼠50只，體質量200～250 g，雌雄各半，制備大鼠含藥血清，上述實驗動物由湖北省醫學科學院提供，動物合格證號：SCXK(鄂)2008-0005。

1.3實驗方法

1.3.1藥物血清的制備參照文獻[4]中方法制備。將12周齡Wistar大鼠50只隨機分成益骨湯高劑量組、益骨湯中劑量組、益骨湯低劑量組、a-D3膠丸組、空白組，每組10只，雌雄各半。益骨湯高、中、低劑量組分別給予益骨湯7.15，3.75，1.05 g/mL灌胃，a-D3膠丸組給予a-D3膠丸0.12 μg/kg灌胃，空白組給予等量生理鹽水灌胃，各組灌胃容量均為1 mL/100 g，1次/d，連續7 d。末次給藥后1 h，頸動脈取血，將采集的血液在室溫中靜置4 h，3 000 r/min離心15 min，收集血清，置于56 ℃水浴30 min進行滅活，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20 ℃保存備用。臨用時用培養液配制成10%的藥物血清。

1.3.2成骨細胞培養參考文獻[5]方法。將新生健康的Wistar大鼠無菌條件下取出顱蓋骨，放入預冷的PBS中，清洗3次，除去附著的脂肪及結締組織，然后用剪刀將顱蓋骨充分剪至1 mm3大小，用0.25%胰蛋白酶預消化25 min，再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化，37 ℃震蕩，60次/min，震蕩10 min，棄上清液，1 000 r/min離心10 min。細胞經PBS洗后，加入含10%胎牛血清的1640培養液中培養，將細胞調整為濃度為1×105mL-1，接種于50 mL培養瓶中培養。第2天換液，以后每2～3 d換液1次。4～7 d，細胞長成致密單層、鋪滿培養瓶底后進行傳代，棄去原培養液，用PBS液沖洗2遍，每瓶加入0.25%胰蛋白酶消化，相差顯微鏡下觀察細胞，約4 min細胞成圓形，1 000 r/min離心10 min，棄去消化液，再用PBS液沖洗1遍，加入培養液，制成細胞懸液，以1×106mL-1計數，接種于新的50 mL培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中靜置培養。

1.3.3含藥血清對成骨細胞增殖的影響(CCK-8法)P3代細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，將濃度調整為1×105mL-1，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液，24 h后按各組要求更換相應培養液，將培養板置5% CO2培養箱中培養48 h，取出培養板，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育1～4 h后，用酶標儀在450 nm波長處測定OD值。

1.3.4ALP活性的測定P3代細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，將濃度調整為1×105mL-1，在6孔板中每孔加入2 mL細胞懸液，24 h后按各組要求更換相應培養液，干預后的第6，9，12天，將培養液吸出，PBS洗2遍，按ALP試劑盒操作步驟，在紫外分光光度計A490處測定OD值，最后換算成金氏單位。

1.3.5鈣鹽沉積量檢測P3代細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，將濃度調整為1×105mL-1，接種于3.5 cm培養皿中，24 h后按各組要求更換相應培養液，干預后的第12，16天取待測樣品，棄培養液，將細胞用PBS洗2遍，每皿加入1 mL 2 mol/L HCl，在震蕩混合儀上震蕩過夜，第2天用移液槍反復吹打后吸入標記離心管，10000r/min離心10min，收集上清液-80 ℃冰箱保存。待各時間點樣品收集全后按照Calcium Colorimetric Assay Kit試劑盒說明操作，在酶標儀570 nm波長處測OD值，計算各孔Ca2+含量，以μg/孔表示。

1.3.6骨鈣素分泌量檢測P3代細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，將濃度調整為1×105mL-1，接種于6孔板中，24 h后按各組要求更換相應培養液，收集成骨誘導后第12，16天各組培養液1 mL，凍存于-80 ℃，待各時間點樣品收集完全后，采用大鼠骨鈣素放射免疫分析試劑盒進行骨鈣素含量測定。在酶標儀450 nm波長處測定OD值，計算各孔骨鈣素含量，以ng/mL表示。

2　結　　果

2.1成骨細胞增殖情況益骨湯高劑量組OD值為41.51±0.35，益骨湯中劑量組OD值為41.57±0.34，益骨湯低劑量組OD值為41.49±0.33，a-D3膠丸組OD值為41.52±0.12，空白組OD值為41.41±0.21。益骨湯高、中、低劑量組和a-D3膠丸組成骨細胞增殖情況均明顯優于空白組(P均<0.05)，而與a-D3膠丸組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，益骨湯高、中、低劑量組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

2.2ALP活性各組ALP活性在第9天上升達到峰值，到第12天時ALP活性開始下降。各時期益骨湯高、中、低劑量組和a-D3膠丸組成骨細胞ALP活性均明顯高于空白組(P均<0.05)，而與a-D3膠丸組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，益骨湯中劑量組與低劑量組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

表1　各組不同時期成骨細胞ALP活性比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與益骨湯低劑量組比較，P<0.05。

2.3鈣鹽沉積量各組鈣鹽沉積量隨著時間的延長逐漸升高。各時期益骨湯高、中、低劑量組和a-D3膠丸組鈣鹽沉積量均明顯高于空白組(P均<0.05)，而與a-D3膠丸組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，益骨湯中劑量組與低劑量組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2　各組不同時期成骨細胞鈣鹽沉積量比較孔)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與益骨湯低劑量組比較，P<0.05。

2.4骨鈣素分泌量各組骨鈣素分泌量隨著時間的延長逐漸增加。各時期益骨湯高、中、低劑量組和a-D3膠丸組骨鈣素分泌量均明顯高于空白組(P均<0.05)，而與a-D3膠丸組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，益骨湯中劑量組與低劑量組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表3。

表3　各組不同時期成骨細胞骨鈣素分泌量比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與益骨湯低劑量組比較，P<0.05。

3　討　　論

中藥血清藥理學是在動物經灌胃給藥一定周期后，處死采血并通過離心分離出血清，用含藥物成分的血清作用于細胞進行體外相關實驗，該方法較好地排除了中藥與細胞直接作用過程中某些因素的干擾，更好地模擬了藥物與機體作用的過程，自20世紀80年代以來已經成為中藥復方研究的重要方法之一[6]。

骨質疏松的組織學機制主要是由于骨重建負平衡所致，與成骨細胞的關系密切。造成骨質疏松的重要原因是成骨細胞增殖受抑制及其分化程度降低。中藥促進成骨細胞的增殖及成骨分化是目前研究的熱點。益骨湯以補骨脂、骨碎補為君藥，淮山藥為臣藥，佐以生地等而組成，其藥用歷史悠久，療效可靠[7]，在臨床有著廣泛應用。本研究擬從細胞水平研究益骨湯含藥血清對成骨細胞增殖及成骨的作用，對于闡明益骨湯補腎壯骨作用的物質基礎及新藥開發具有重要意義。

成骨細胞合成和分泌骨基質的有機成分形成類骨質，并釋放基質小泡。基質小泡膜上有鈣結合蛋白(如骨鈣素等)和ALP，它們在鈣化的過程中起了重要的作用[8]。成骨細胞不斷形成類骨質，類骨質鈣化為骨組織，從而保證骨的生長發育和修復[9]。ALP活性是成骨細胞分化成熟的早期標志，能夠反映成骨細胞的分化程度和功能狀態，也是反映藥物效應的直接指標。骨鈣素是骨基質礦化的必需因子，維持骨的正常礦化，被認為是成骨細胞分化最具特征性的標志物，當成骨細胞活動增強時，骨鈣素活性升高[10-11]。本實驗發現益骨湯含藥血清能促進成骨細胞ALP的分泌，提高ALP活性，從細胞水平上闡明了其治療骨質疏松的可能機制，同時還發現益骨湯含藥血清可以促進鈣鹽沉積及骨鈣素分泌。由此證明益骨湯含藥血清可以促進成骨細胞增殖及成骨分化。本實驗結果與祖國醫學理論“補腎、堅筋骨”相符合，但益骨湯含藥血清的具體有效成分還不清楚，其作用機制還有待于進一步研究。

[1]劉忠厚. 骨質疏松癥[M]. 北京：化學工業出版社，1992：439-443

[2]陳芳，朱以良，楊李，等. 益骨湯含藥血清對新生大鼠成骨細胞增殖及分泌IL-6的影響[J]. 實驗動物與比較醫學，2012，32(2)：146-148

[3]陳芳，張宜，劉琴，等. 益骨湯對體外培養成骨細胞增殖及分泌胰島樣生長因子I的影響[J]. 中國藥師，2014，17(1)：26-28

[4]張秋燕，崔翰明，劉喜明，等. 白鴿甲腫消制劑及其含藥血清中哈巴俄苷的含量測定[J]. 時珍國醫國藥，2010，21(2)：10-11

[5]張玨，陳曉禾，李莉，等. 鹽酸四環素緩釋微球對大鼠成骨細胞活性的影響[J]. 華西藥學雜志，2010，25(1)：1-3

[6]張靈娜，林兵，宋洪濤. 中藥血清藥理學、血清藥物化學的研究概況及展望[J]. 中草藥，2015，46(17)：2662-2666

[7]劉振武. 補腎益骨湯治療骨質疏松性骨折69例臨床觀察[J]. 河北中醫雜志，2010，32(4)：521-522

[8]鄒仲之，蔡文琴. 組織學與胚胎學[M]. 北京：人民衛生出版社，2004：48-52

[9]張志長，李菲，毛金軍，等. 含中藥骨金散血清對大鼠成骨細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響[J]. 黑龍江醫藥科學，2012，35(3)：4-6

[10] 李會珍，李蒙，李瑞玉，等. 淫羊藿對骨髓間充質干細胞成骨分化的影響[J]. 中國組織工程研究，2014，18(6)：979-984

[11] 宋淵，李盛華，何志軍. 骨碎補含藥血清對成骨細胞增殖、成骨的影響[J]. 中國骨質疏松雜志，2014，20(2)：125-128

Effects of serum containing Yigutang on bone-formation of osteoblasts

CHEN Fang，LIU Qin，WANG Liping，ZHANG Yi

(Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Region, Wuhan 430070, Hubei, China)

Objective It is to study the effects of serum containing Yigutang on proliferation, osteoblastic differentiation of osteoblasts in newborn rats. Methods Iliac bone specimens were obtained from the calvaria of newborn rats and divided into high, medium and low dosage groups of Yigutang, a-D3 group and blank group. After the bone pieces were digested with collagenase-trypisn, osteoblasts were released and fed with RPMI1640, the cells of the third passage were cultured for 24 h, then the medium was replaced by Yigutang containing serum, and the cells were cultured for another 48 h. The proliferation rate of cells, ALP activity, sediment yield of calcium salt and secretory volume of osteocalcin were detected respectively through interventing with serum contained Yigutang.Results Proliferation rate, ALP activity, sediment yield of calcium, secretory volume of osteocalcin in high, medium and low dosage groups of Yigutang, a-D3 group were better than that of blank control group (P<0.05), but there was no significant difference between Yigutang groups and a-D3 group(P>0.05). Conclusion Serum contained Yigutang could promote the prolifemation and osteoblastic differentiation of osteoblasts.

osteoblasts; proliferation and differentiation; Yigutang；medicated serum

陳芳，女，碩士，主管藥師，研究方向為藥物血清及細胞生物學研究。

張宜，E-mail: hbpizy@tom.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.17.008

R-33

A

1008-8849(2016)17-1848-03

2016-01-16