消渴通痹顆粒對糖尿病大鼠下肢缺血肌組織HIF-1α和VEGF表達的影響

張效科，袁有才，鄧　翀，李　瑤，劉　夢

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

?

論著

消渴通痹顆粒對糖尿病大鼠下肢缺血肌組織HIF-1α和VEGF表達的影響

張效科，袁有才，鄧翀，李瑤，劉夢

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

目的觀察消渴通痹顆粒對糖尿病大鼠下肢缺血肌組織缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達的影響。方法取SD大鼠60只，隨機取10只作為空白組，其余大鼠采用高脂飲食復合鏈脲佐菌素、股動脈結扎法建立糖尿病大鼠下肢缺血模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組，消渴通痹顆粒大、中、小劑量組及西醫藥組，空白組及模型組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，消渴通痹顆粒大、中、小劑量組分別給予消渴通痹顆粒1.875 g/(kg·d)、1.35 g/(kg·d)、0.625 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予西洛他唑45 mg/(kg·d)灌胃，連續灌胃6周。觀察大鼠一般情況及體質量、血糖變化，取缺血側肌肉采用實時定量PCR法檢測HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達情況。結果消渴通痹顆粒大、中、小劑量組灌胃6周后大鼠體質量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且消渴通痹顆粒中劑量組大鼠體質量明顯高于消渴通痹顆粒大、小劑量組(P均<0.05)；消渴通痹顆粒中劑量組血糖水平明顯低于模型組及其他給藥組(P均<0.05)。模型組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，各給藥組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且消渴通痹顆粒中劑量組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯低于消渴通痹顆粒大劑量組(P均<0.05)。結論消渴通痹顆粒可通過增加缺血部位肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達而促進缺血組織新生血管形成，改善糖尿病肢體缺血狀態。

糖尿病；消渴通痹顆粒；HIF-1αmRNA；VEGFmRNA

糖尿病下肢缺血病變是糖尿病最常見的慢性并發癥之一，包括周圍神經、血管及肌肉組織損害，其發病與肢體微血管病變導致的低灌注有密切關系，所以改善肢體的微循環是防治的主要方法[1-2]。除傳統的降糖、降脂、擴張血管、營養神經等治療外，血運重建是治療的關鍵，血管新生促進側支循環建立，替代損傷的微血管是潛在的方向。本實驗在前期研究的基礎上，采用高脂飲食復合鏈脲佐菌素 (STZ)、股動脈結扎法建立糖尿病大鼠下肢缺血模型，觀察了消渴通痹顆粒對糖尿病下肢缺血病變大鼠缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)和血管內皮生長因子(VEGF)mRNA表達的影響，現將結果報道如下。

1　實驗資料

1.1實驗動物清潔級SD大鼠60只，雌雄各半，體質量(200±20)g，由西安交通大學醫學院動物實驗中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-003。

1.2藥物與試劑消渴通痹顆粒(黃芪、當歸、葛根、桑白皮、威靈仙、祖師麻)由陜西中醫學院附屬醫院制劑室提供，每克相當于原藥4.95 g；西洛他唑片，浙江大冢制藥有限公司生產，50 mg/片，國藥準字H10960014； STZ，美國Sigma公司；TRIzol Reagent(Invitrogen 公司)，批號：14105；Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(DRR037A)(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd公司)，批號：BK1301；SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ[Perfect Real Time(DRR081A)(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd公司)]，批號：AK2503。引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成， GAPDH：Forward TAC CCA CGG CAA GTT CAA CG，Reverse CAC CAG CAT CAC CCC ATT TG；HIF-1a：Forward AGA GTT ACC TGC CCT GTC CT，Reverse AGT AGC AGT GGC TGT GGT TC；VEGF：ForwarTAT CTT CAA GCC GTC CTG TG，Reverse CTC CTA TGT GCT GGC TTT GG。實時定量PCR儀，BIO-RAD公司IO5TM Multicolor Real-Time PCR Detection System；RNA定量儀，美國Nano Drop ND-1000 spectrophotometer。

1.3實驗方法大鼠于自然光線、自由飲水攝食條件下適應性喂養1周。隨機選擇10只作為空白組，喂飼普通飼料。其余大鼠喂飼高脂飼料，高脂飼料配方為:普通飼料70%、動物油15%、膽固醇5%、蔗糖10%,制成塊料,烤干備用,每次配1周的用量。高脂飼料喂養1個月后，禁食12 h后，用0.1%枸櫞酸緩沖液(pH 4.2，4 ℃)將STZ配成1%濃度，45 mg/kg左下腹腔單次注射，72 h后尾靜脈采血，拜耳血糖儀測定血糖，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功，3 d后再次尾靜脈采血測血糖達標者進入下一造模環節。取糖尿病成模大鼠以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉，切開左股內側皮膚，分離股動靜脈，在坐骨神經分三叉處，用絲線永久結扎股動靜脈，縫合切口，制成單側肢體缺血模型[3]，術后常規傷口涂紅霉素，注射青霉素預防感染。將造模成功的大鼠隨機分為模型組8只、消渴通痹顆粒大劑量組9只、消渴通痹顆粒中劑量組9只、消渴通痹顆粒小劑量組8只和西藥組8只。空白組及模型組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，消渴通痹顆粒大、中、小劑量組分別給予消渴通痹顆粒1.875 g/(kg·d)(相當于成人每千克體質量用藥量的15倍，成人按60 kg計)、1.35 g/(kg·d)、0.625 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予西洛他唑45 mg/(kg·d)(相當于成人每千克體質量用藥量的15倍)灌胃，均1次/d。每2周根據大鼠體質量變化調整給藥劑量，實驗中大鼠全部不限制飲水與飲食，不給予其他藥物治療，連續灌胃6周。

1.4觀察指標

1.4.1一般指標觀察造模前后及灌胃后大鼠一般狀態(精神、毛發、色澤)、飲水及攝食量、體質量、血糖變化情況。

1.4.2肌肉組織的采集實驗結束后，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，從左下肢手術造模部位下端取1小塊肌肉組織，迅速分為4份放入冷凍管入液氮凍存，標本采集結束后移至-80 ℃冰箱備用。

1.4.3下肢肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達檢測采用實時定量PCR法檢測。取-80 ℃保存的肌肉組織100 mg，Trizol法抽提總RNA，RNA定量后Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time(DRR037A)反轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。采用SYBY Premix Ex TaqTM Ⅱ[Perfect Real Time(DRR081A)]試劑盒檢測。25 μL反應體系，反應條件: 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環反應40次，PCR反應結束后，將PCR反應液溫度自60 ℃緩慢升溫至95 ℃，實時監測SYBR GreenⅠ的熒光信號強度變化，獲取溶解曲線，以確認PCR反應的特異性。反應結束后獲取循環閾值(CT值)，對拷貝數以10為底取對數作為橫坐標，CT值為縱坐標，采用Excel軟件繪制標準曲線，進行實驗數據分析。

2　結　　果

2.1各組大鼠一般情況及體質量、血糖變化情況各造模組大鼠高脂喂養后體質量明顯增加，鏈脲佐菌素腹腔注射后大鼠多尿、多飲、消瘦明顯，血糖明顯升高，股動脈結扎后下肢缺血明顯。消渴通痹顆粒大、中、小劑量組灌胃6周后大鼠體質量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且消渴通痹顆粒中劑量組大鼠體質量明顯高于消渴通痹顆粒大、小劑量組(P均<0.05)；消渴通痹顆粒中劑量組血糖水平明顯低于模型組及其他給藥組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠干預后體質量及血糖情況±s)

注:①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與消渴通痹顆粒中劑量組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠下肢肌組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達情況模型組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)，各給藥組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且消渴通痹顆粒中劑量組HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達量均明顯低于消渴通痹顆粒大組(P均<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠下肢肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達情況

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與消渴通痹顆粒中劑量組比較，P<0.05。

3　討　　論

微血管病變是糖尿病周圍神經病變、下肢動脈病變、糖尿病足及糖尿病肌病的主要發病學說之一，該學說認為微血管病變所致神經肌肉組織灌注不足而致其缺氧缺血導致病理損害以致出現臨床癥狀。組織缺氧缺血在糖尿病發病早期即存在[4]，而HIF-1α是調節細胞內氧代謝的關鍵因子之一，在低氧狀態下能夠穩定存在，而在常氧狀態下迅速降解,其調控缺氧引起的血管新生、細胞凋亡等多種細胞適應性反應[5]，在血管新生信號的產生中起到關鍵作用，其通過調控下游VEGF基因編碼轉錄發揮作用[6]，并可以在骨髓動員內皮細胞祖細胞中進行內皮重塑[7],從而形成成熟的新生血管[8]。

消渴通痹顆粒是陜西中醫藥大學治療糖尿病周圍神經病變的專利藥物，由黃芪、當歸、葛根、桑白皮、威靈仙、祖師麻組成，具有益氣活血、通絡止痛的作用，前期的研究顯示該方能促使糖尿病大鼠新生血管的生成，減輕髓鞘損傷等[9-10]。本實驗在前期基礎上增加了高脂喂養造模，有利于形成肥胖及胰島素抵抗，更接近臨床改變。實驗發現糖尿病周圍神經病變支配區域的肌肉組織處在缺氧缺血狀態，肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達均顯著上升，中藥消渴通痹顆粒中劑量可顯著下調肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表達。由此推測消渴通痹顆粒可通過增加缺血部位肌肉組織中HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表達而促進缺血組織新生血管形成，改善糖尿病肢體缺血狀態。

[1]中華醫學會糖尿病學分會. 中國2型糖尿病防治指南(2013年版)[J]. 中國糖尿病雜志，2014，22(8)：2-42

[2]葛均波，徐永健. 內科學[M]. 8版. 北京：人民衛生出版社，2013：739

[3]馮樹行，杜軍，吳曉青，等. 大鼠缺血性周圍神經病的實驗模型制作[J]. 沈陽部隊醫藥，2006,6(4):240-242

[4]鄭全林，徐向進. 缺氧誘導因子-1與糖尿病慢性血管并發癥[J]. 實用醫學雜志，2009，25(4)：671-672

[5]艾麗根，劉芳. 缺氧誘導因子-1α與糖尿病血管新生的研究進展[J]. 中國糖尿病雜志，2015，23(5)：470-474

[6]Semenza GL. Vascular responses to hypoxia and ischemia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(4):648-652

[7]Lee JH,Gao Z,Ye J. Regulation of 11 beta-HDS1 expression during adipose tissue expansion by hypoxia through different activities of NF-kappa B and HIF-1alpha[J]. Am J Physiol Endorinol Metab,2013,304(10):1035-1041

[8]Darland DC,D’Amore PA. Blood vessel maturation: vascular development comes of age[J]. J Clin Invest,1999,103(2):157-158

[9]張效科，陳偉銘，雷穎，等. 消渴通痹顆粒對高血糖狀態下缺血性周圍神經病變大鼠新生血管及神經結構影響的觀察[J]. 中成藥，2011，33(11)：1972-1975

[10] 張效科，陳偉銘，袁有才，等. 消渴通痹顆粒對糖尿病大鼠坐骨神經分子免疫及血清炎癥因子的影響[J]. 時珍國醫國藥，2015，26(2)：267-269

Effects of Xiaoke Tongbi Granule on the expression of HIF-1α and VEGF in ischemia tissue of lower limb muscle of diabetic rats

ZHANG Xiaoke, YUAN Youcai, DENG Chong, LI Yao, LIU Meng

(Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shaanxi, China)

Objective It is to observe the effects of Xiaoke Tongbi Granule on the expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in ischemia tissue of lower limb muscle of diabetic rats. Methods 10 SD rats were randomly selected as the blank control group, and the other rats were established by high fat diet, STZ and femoral artery ligation was used to establish the model of the lower limb ischemia in diabetic rats. successful model rats were randomly divided into model group, large, medium and small dose groups for Xiaoke tongbi granule, and western medicine group, blank control group and model group were given normal saline 10 mL/(kg·d), XiaoKe Tongbi Granules of large, medium and small dose groups were treated with Xiaoke Tongbi Granule 1.875 g/ (kg·d), 1.35 g/ (kg·d), 0.625 g/ (kg·d) by gavage. The western medicine group was given cilostazol 45 mg/(kg·d) by gavage, all the rats were treated for 6 weeks. The general situation, body weight and blood glucose of rats were observed, and the expression of HIF-1mRNA and VEGFmRNA were detected by real-time quantitative PCR. Results The weight of the rats of large, medium and small dose group were significantly higher than those in the model group (P<0.05), after 6 weeks’ treatment. Moreover, the rats body weight of medium dose group was significantly higher than that of large and small dose group (P<0.05). Blood sugar level of medium dose group was significantly lower than that of model group and other groups (P<0.05). In model group the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA were significantly higher than those in the blank group (P<0.05); in the treatment group the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA were significantly lower than those in the model group (P<0.05) ; the expression levels of HIF-1αmRNA and VEGFmRNA in medium dose group were significantly lower than that of large dose group (P<0.05). Conclusion Xiaoke TongBi Granule can increase HIF-1αmRNA and VEGFmRNA expression in the ischemic muscular tissue and promote angiogenesis, improve diabetic ischemic status of the limb.

diabetes mellitus; Xiaoketongbi Granule; HIF-1αmRNA; VEGFmRNA

張效科，男，教授，博士生導師，主任醫師，研究方向為糖尿病及其并發癥的中醫藥防治。

袁有才，E-mail:yyc0807@163.com

國家自然科學基金資助項目(81273750；81374028)；陜西省自然科學基金資助項目(2012jM4016)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.17.001

R-332

A

1008-8849(2016)17-1825-03

2016-02-25