艾塞那肽對單純性肥胖合并糖調節受損模型大鼠脂肪因子及體質量的影響

李曉明，趙　娜，郭　芳

(1.河北省人民醫院，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050031)

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艾塞那肽對單純性肥胖合并糖調節受損模型大鼠脂肪因子及體質量的影響

李曉明1，趙娜1，郭芳2

(1.河北省人民醫院，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050031)

目的觀察艾塞那肽對單純性肥胖合并糖調節受損模型大鼠脂肪因子和體質量的影響。方法取60只Wistar大鼠，隨機選擇10只作為空白組，其余50只大鼠通過喂養高脂飼料與注射鏈脲佐菌素方法制備單純性肥胖合并糖調節受損模型，將造模成功大鼠隨機分為艾塞那肽組、二甲雙胍組與模型組。空白組、模型組給予生理鹽水6 mL/kg灌胃；二甲雙胍組給予二甲雙胍混懸液250 mg/(kg·d)灌胃;艾賽那肽組皮下注射艾賽那肽10 μg/kg，2次/d。實驗周期6周，比較4組大鼠體質量、Lee’s指數、腹部脂肪濕質量、肝臟形態學病理表現及血清瘦素(Leptin)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平變化。結果干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組體質量、Lee’s指數及腹部脂肪濕質量均明顯低于模型組(P均<0.05)，且艾賽那肽組體質量明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)，艾賽那肽組Lee’s指數明顯低于干預前(P<0.05)。干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組肝組織病理改變明顯輕于模型組；二甲雙胍組和艾賽那肽組血清Leptin、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且艾賽那肽組血清TNF-α水平明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)，二甲雙胍組和艾賽那肽組IL-6水平與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。結論艾塞那肽可有效減慢單純性肥胖合并糖調節受損大鼠體質量增長速度，降低大鼠Lee’s指數及血清Leptin、TNF-α水平，并可能通過減輕Leptin抵抗及下調TNF-α水平以減輕中心性肥胖及肥胖慢性炎癥狀態。

肥胖；瘦素；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；艾塞那肽

肥胖癥是人體攝入能量過多而消耗不足的一種慢性能量失衡狀態。國際肥胖特別工作組研究顯示，現代社會肥胖癥已成為最嚴重且蔓延速度最快的公共衛生問題之一[1]。單純性肥胖癥不僅可降低肥胖人群生活質量，更為重要的是肥胖與高血壓病、糖尿病、動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)、高血脂癥等多種疾病密切相關，進而嚴重危害人類健康。艾塞那肽為胰高血糖素樣肽-1(GLP-1) 類似物的一種，其降低血糖的作用機制為通過激活GLP-1受體，刺激葡萄糖依賴的胰島素分泌，從而抑制胰高血糖素分泌，延緩胃排空及食欲，增加細胞質量[2]。為進一步探討其作用機制，筆者通過建立單純性肥胖合并糖調節受損大鼠模型，觀察了該藥對大鼠體質量及脂肪因子的影響，現將結果報道如下。

1　實驗資料

1.1動物成年健康雄性Wistar大鼠60只，清潔級，體質量(200±20)g，河北醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(冀)2013-1-003。常規飼料分籠飼養，自由飲水。

1.2試劑PBS緩沖液(磷酸緩沖液)，河北省人民醫院實驗中心提供；96T大鼠瘦素(Leptin)ELISA試劑盒，美國R&D有限公司； 96T大鼠白細胞介素-6(IL-6)ELIAS試劑盒，美國R&D有限公司；96T大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒，美國R&D有限公司。

1.3藥品艾塞那肽，美國Amylin公司生產，國藥準字H20090382；鹽酸二甲雙胍，齊魯制藥有限公司生產，國藥準字H37020561；10%的水合氯醛麻醉劑，河北省人民醫院實驗中心提供。

1.4儀器電子分析天平，METTLERAE240瑞士梅特勒公司； -80 ℃超低溫冰箱；Elx50型洗板機；全波長酶標儀，美國BioTek公司；gavplus型超純水系；ClassⅡ2085型超凈工作臺，美國Thermo Forma公司；H-7500型透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司；Leica石蠟切片機及石蠟包埋機，德國LEICA公司；低溫高速冷凍離心機，德國Eppendorf。

1.5實驗方法將大鼠60只適應性喂養1周后，隨機選擇10只作為空白組，喂飼普通飼料(購于河北醫科大學實驗動物中心，其中脂肪占10.2%，蛋白質占23.3%，碳水化合物占66.5%，能量13.4 kJ/g)；余50只大鼠進行造模，喂飼高脂飼料(清潔級高脂飼料購于河北醫科大學實驗動物中心，配方：10.0%豬油，10.0%蔗糖，15.0%蛋黃粉，2.5%膽固醇,1.5%食鹽和61%常規飼料，能量22.8 kJ/g，其中脂肪占59.0%，蛋白質占7.0%，碳水化合物占34.7%)，造模期間自由飲水、攝食，飼料和水每天更換1次。高糖高脂飼料喂飼6周后，將體質量超過普通飼料喂飼大鼠平均體質量20%的大鼠作為單純性肥胖模型大鼠，剔除體質量未達標準或體質量增長緩慢、有肥胖抵抗特性大鼠。單純性肥胖模型大鼠在禁食不禁水12 h條件下，一次性腹腔內注射鏈脲佐菌素10 mg/kg，空白組大鼠按0.1 mL/100 g劑量腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L,pH 4.5)。3 d后單純性肥胖模型大鼠禁食不禁水12 h后，予20%葡萄糖液灌胃(1 mL/100 g)，分別于0 min及120 min時尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)及2 h血糖(2hPG)，FBG>6.1 mmol/L且<7.0 mmol/L和/或2hPG>7.8 mmol/L且<11.1 mmol/L判定為單純性肥胖合并糖調節受損大鼠成模。剔除體質量未達標準或增長緩慢大鼠19只，造模成功31只，單純性肥胖模型造模成功率62.0%，后單純性肥胖合并糖調節受損大鼠造模成功26只(5只大鼠血糖超出標準予以剔除)。將造模成功的26只大鼠隨機分為模型組8只、二甲雙胍組9只、艾賽那肽組9只，空白組、模型組給予生理鹽水6 mL/kg灌胃；二甲雙胍組給予用生理鹽水配制的二甲雙胍混懸液250 mg/(kg·d)灌胃，每天灌胃量為6 mL/kg(濃度為41.67 mg/mL)；艾賽那肽組皮下注射艾賽那肽10 μg/kg，2次/d。觀察周期總計6周。

1.6檢測指標及方法

1.6.2大鼠肝臟組織形態學取1.6.1步驟下大鼠肝臟組織，固定后送河北省人民醫院病理科，以石蠟包埋，常規梯度乙醇脫水，制成厚度4 μm切片，行HE染色，以光鏡觀察大鼠肝臟組織病理學變化。

1.6.3血清Leptin、IL-6、TNF-α水平取1.6.1步驟下大鼠腹主動脈血液10 mL，靜置2～3 h，12 000 r/min離心10 min后留取血清，-80 ℃超低溫凍存后擇期應用酶聯免疫法檢測血清Leptin、IL-6、TNF-α水平，檢測時嚴格按照試劑盒要求操作。

2　結　　果

2.1各組大鼠不同時間體質量比較在干預的前4周，艾賽那肽組、二甲雙胍組體質量增長較模型組緩慢，但差異均無統計學意義(P均>0.05)；干預5周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組體質量均明顯輕于模型組(P均<0.05)；干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組體質量均明顯輕于模型組(P均<0.05)，且艾賽那肽組體質量明顯輕于二甲雙胍組(P<0.05)。見表1。

表1　各組大鼠不同時間體質量比較±s，g)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與二甲雙胍組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠干預前后Lee’s指數比較干預前，肥胖各組Lee’s指數均顯著高于空白組(P均<0.05)，提示造模成功；干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組Lee’s指數均明顯低于模型組(P均<0.05)，且艾賽那肽組Lee’s指數明顯低于干預前(P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠干預前后Lee’s指數比較±s)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與干預前比較，P<0.05。

2.3各組大鼠腹部脂肪濕質量比較空白組腹部脂肪濕質量為(16.62±4.60)g，模型組為(36.20±9.25)g，二甲雙胍組為(22.90±5.09)g，艾賽那肽組為(19.64±5.45)g。二甲雙胍組和艾賽那肽組腹部脂肪濕質量均明顯低于模型組(P均<0.05)。

2.4各組大鼠肝臟組織形態學比較干預6周后，相較于空白組大鼠肝臟組織形態，模型組大鼠肝臟肝索排列紊亂，基本無放射狀排列，肝細胞體積增大、濁腫，部分輕度變形，可見大小不等的脂肪空泡，部分肝細胞出現壞死，匯管區可見大量炎性細胞浸潤；二甲雙胍組肝細胞腫脹不明顯，可見輕度脂肪變性，胞漿內仍有脂肪空泡，但較模型組減少，匯管區有少量炎性細胞浸潤；艾賽那肽組大鼠肝臟細胞結構基本完整，脂肪腫脹變性并不明顯，細胞內偶見脂肪空泡，基本未見炎性細胞浸潤，無肝細胞壞死。

2.5各組大鼠血清Leptin、TNF-α、IL-6水平比較模型組血清Leptin、TNF-α、IL-6水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；二甲雙胍組和艾賽那肽組血清Leptin、TNF-α水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，且艾賽那肽組血清TNF-α水平明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)；二甲雙胍組和艾賽那肽組IL-6水平與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

3　討　　論

根據2000年世界衛生組織對肥胖的判定標準及定義，單純性肥胖癥首次被定義為一種與生活方式密切相關的全身性脂肪過度增生的慢性疾病，其主要特征為 “過度營養”“運動不足”“行為偏差”，一般來說，肥胖癥主要以體內脂肪堆積過多和/或分布異常、體質量增加為主要表現，其中脂類物質的形成、聚集是肥胖癥一系列危害性的基礎[3-4]。脂肪作為生物體的能量提供者，對人類生命個體的正常生理過程具有極為重要的意義[5]。當沒有外來食物、能量供應時,機體需要動員脂肪分解釋放出游離脂肪酸以滿足各個器官需求，而當進食過多能量飲食時，機體會將多余脂肪以三酰甘油形式儲存于體內[6]。我國自上世紀80年代改革開放以來，由于經濟的迅速發展，以往以低脂肪、高膳食纖維、碳水化合物為膳食結構特點的谷類物質膳食結構逐漸丟失[7]，代之以動物性、脂肪類物質急劇增加、谷類物質迅速減少的類西方膳食結構[8]，造成近幾十年來單純性肥胖癥發病率不斷增高,脂類物質的聚集成為肥胖癥發病的重要原因。現有研究顯示，中心性肥胖是2型糖尿病的獨立危險因素，相比全身性肥胖更易導致2型糖尿病[9]，且與心血管疾病的發生發展密切相關[10-11]；另外內臟組織的脂肪沉積和脂代謝紊亂有密切的關系，而脂肪代謝的動態平衡會因代謝環節中的異常而發生改變[12]，最終導致肝細胞的脂肪堆積及肝臟微循環障礙等一系列結果[13]，減重可有效改善甚至逆轉肝細胞脂肪沉積[14]，而脂肪沉積的改變亦會促進體質量下降及脂質代謝紊亂。

表3　各組大鼠血清Leptin、TNF-α、IL-6水平比較

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

目前研究表明，艾塞那肽的作用與內源性GLP-l非常相似，兩者均能提升機體內胰島素分泌水平，并能抑制餐后胰高血糖素的分泌，降低肝糖原的輸出量，延長胃內容物的存留時間[15],它還能刺激中樞神經,增加患者的飽腹感,進而減少患者食物的攝入量，幫助其減輕體質量，達到控制疾病發展的目的[16]。本研究通過建造與人相似的肥胖生成過程，并以小劑量鏈脲佐菌素破壞胰島細胞，更為完整地模擬出肥胖合并糖調節受損及代謝綜合征整體發生過程，使實驗更準確可靠，并應用艾賽那肽及確有減重效果的西藥二甲雙胍對模型大鼠進行干預，旨在評價艾賽那肽對內臟脂肪及脂肪組織慢性炎癥反應的作用。結果顯示，在干預的前4周，艾賽那肽組、二甲雙胍組大鼠體質量增長較模型組緩慢，但差異均無統計學意義；干預5周后和干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組體質量均明顯輕于模型組，且干預6周后艾賽那肽組體質量明顯輕于二甲雙胍組；干預6周后，二甲雙胍組和艾賽那肽組Lee’s指數及腹部脂肪濕質量均明顯低于模型組，且艾賽那肽組體質量明顯低于二甲雙胍組，艾賽那肽組Lee’s指數明顯低于干預前。提示艾賽那肽與二甲雙胍具有相似甚至更為優秀的減重療效，且可有效減低評價成年肥胖模型大鼠肥胖程度的Lee’s指數[17]，進一步明確了艾賽那肽的減重療效；且艾賽那肽在減重的同時可有效減輕肝細胞脂肪變性，而肝細胞脂肪變性減輕可使肝細胞內肝脂酶合成及活性增加，進一步減少肝臟脂肪沉積，減輕中心性肥胖，改善胰島素抵抗。

脂肪組織根據現今研究顯示不僅是能量儲存場所，更具內分泌功能，可分泌多種細胞炎癥因子，如TNF-α、Leptin、IL-6、脂聯素、抵抗素和蛋白纖維酶原激物抑制劑-1(PAI-1)等[18]，這些脂肪因子可干擾血管生理和新陳代謝，并參與到一系列與肥胖癥相關疾病的發生發展中[19]。脂肪因子炎癥因子表達的增多，也是單純型肥胖癥與胰島素抵抗密切聯系的潛在機制[20]。本研究結果顯示，模型組血清Leptin、TNF-α、IL-6水平均明顯高于空白組；二甲雙胍組和艾賽那肽組血清Leptin、TNF-α水平均明顯低于模型組，且艾賽那肽組血清TNF-α水平明顯低于二甲雙胍組；二甲雙胍組和艾賽那肽組IL-6水平與模型組比較差異均無統計學意義。提示艾賽那肽可有效減輕肥胖合并糖調節受損大鼠血清Leptin抵抗及慢性炎癥抵抗狀態，并可能以此為機制減輕胰島素抵抗。

綜上所述，艾塞那肽可有效減慢單純性肥胖合并糖調節受損大鼠體質量增長速度，降低大鼠Lee’s指數及血清Leptin、TNF-α水平，并可能通過減輕Leptin抵抗及下調TNF-α水平以減輕中心性肥胖及肥胖慢性炎癥狀態。

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Effect of Exenatide on adipokines and body weight in model rats with simple obesity and impaired glucose regulation

LI Xiaoming1,ZHAO Na1,GUO Fang2

(1.The General Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050051,Hebei,China; 2.Hebei Medical University,Shijiazhuang 050031,Hebei,China)

Objective It is to observe the effect of Exenatide on adipokines and body mass in rats model of simple obesity with impaired glucose regulation (IGR).Methods 60 Wistar rats were selected and randomly divided into 2 groups,10 in control group and 50 in the model group.Through high fat feeding and by given Streptozotocin,the rats in model group were randomly divided into the Exenatide group,metformin group and model control group.Control group and model group were given normal saline 6 mL/kg by gavage; metformin group were given metformin configured by saline suspension 250 mg/(kg·d) by gavage; Exenatide group were given Exenatide 10 μg/kg by subcutaneous,2 times a day.The experiment lasted six weeks,compared body weight,liver pathology observed morphology,serum leptin (Leptin),tumor necrosis factor-α(TNF-α),and interleukin-6 (IL-6) content change of four groups.Results Six weeks after the intervention,compared with the control group,body mass of the metformin group and Exenatide group was significantly reduced (P<0.05),Exenatide group was more effective on lose body mass than metformin group (P<0.05);compared with pre-intervention,Lee’s index of Exenatide group was significantly reduced (P<0.05),compared with the control group,Lee's index of Exenatide group and metformin group was significantly lower after the intervention (P<0.05); after drugs intervention,compared with the control group,abdominal fat wet weight of exenatide group decreased significantly (P<0.01),metformin group also decreased (P<0.05);After high fat diet,compared with the control group,Leptin,TNF-α,IL-6 of model group were significantly higher (P<0.01,P<0.05),compared with the control group,Exenatide group and metformin group significantly decreased serum Leptin and TNF-α levels (P<0.05),but no significant differences in IL-6 levels.Conclusion Exenatide can effectively slow down the growth rate of body mass of rats,induced a significant reduction of Lee's index,reduce abdominal fat wet weight,reduce central obesity,and can effectively reduce serum Leptin and TNF-α levels of simple obese rats,the mechanism may be by ease Leptin resistance and reducing TNF-α levels to reduce obesity and chronic inflammatory state.

obesity;Leptin; TNF-α; IL-6; Exenatide

李曉明，女，主管藥師，從事藥學研究工作。

E-mail:1661009771@qq.com

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.16.009

R-335

A

1008-8849(2016)16-1741-04

2015-10-10