微小核糖核酸-21對乳腺癌MCF-7細胞反轉錄富含半胱氨酸蛋白表達的調節研究

鄭志偉，趙樹林，楊鈺賢，朱輝德，朱志偉，陳 蕾

·基礎研究·

微小核糖核酸-21對乳腺癌MCF-7細胞反轉錄富含半胱氨酸蛋白表達的調節研究

鄭志偉，趙樹林，楊鈺賢，朱輝德，朱志偉，陳 蕾

目的 探討乳腺癌MCF-7細胞中微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）對反轉錄富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）表達的調控作用。方法 將miR-21模擬物、miR-21抑制物及模擬物陰性對照、抑制物陰性對照各組瞬時轉染到MCF-7細胞中，48 h后通過熒光定量聚合酶鏈反應檢測miR-21在細胞的表達情況，蛋白質印跡法檢測轉染后RECK表達水平變化。結果 細胞轉染48 h后，miR-21抑制物組和miR-21模擬物組miR-21的表達分別與轉染空白對照組比較差異有統計學意義（P＜0.001），轉染miR-21抑制物組miR-21的表達明顯下降，轉染miR-21模擬物組miR-21的表達明顯上調；細胞轉染miR-21各組后RECK表達差異有統計學意義（P＜0.01），miR-21抑制物組相對其陰性對照組，RECK表達明顯上升（P＜0.001）；miR-21模擬物組相對其陰性對照組，RECK表達明顯下降（P＜0.001）。結論miR-21可以抑制乳腺癌MCF-7細胞RECK表達，可能成為判斷乳腺癌患者預后的評價指標及腫瘤治療的新靶點。

乳腺癌；微小核糖核酸-21；反轉錄富含半胱氨酸蛋白

［Abstract］Objective To explore the effects of microRNA-21（miR-21）on the expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）in MCF-7 cells.Methods

MCF-7 cells were cultured in vitro and transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor by cationic-mediated transfected.The total RNA and protein were extracted from the culture cells after transfected forty-eight hours.The expression of miR-21 and RECK levels were detected by fluorescent quantitative PCR and Western blotting.Results The miR-21 expression was significantly changed after forty-eight hours transfected（P＜0.001），miR-21 expression decreased significantly in miR-21 inhibitor group while miR-21 expression increased significantly in miR-21 mimics group. The RECK was significantly changed after transfected（P＜0.001），RECK expression increased significantly in miR-21 inhibitor group（P＜0.001）while RECK expression decreased significantly in miR-21 mimics group（P＜0.001）.Conclusion miR-21 can inhibit the expression of RECK in breast cancer cells，and it may be a new target to judge the prognosis of breast cancer patients and the new target of tumor therapy.

［Key words］Breast cancer；MicroRNA-21（miR-21）；Reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs（RECK）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。城市地區女性乳腺癌每年新發病例約15.8萬，占全部女性癌癥發病的19.47%，發病率為46.74/10萬，位居女性腫瘤發病之首。2011年中國女性乳腺癌發病人數約24.9萬，發病率37.86/10萬，近10年乳腺癌病死率呈上升趨勢［1］。微小核糖核酸-21（microRNA-21，miR-21）是miRNAs家族成員之一，miR-21高表達與乳腺癌臨床分期、淋巴結轉移、浸潤等惡性行為具有正相關性，因而進一步開展miR-21對乳腺癌分子生物學調控的研究。通過生物信息學軟件TargetScan預測，反轉錄富含半胱氨酸蛋白（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）基因有可能是其調節的靶基因之一。RECK基因是一種新型基質金屬蛋白酶抑制劑。研究發現，RECK基因作為新型的腫瘤轉移抑制基因，能夠有效地抑制腫瘤的侵襲與轉移［2-3］。有臨床研究進一步證明，RECK基因表達水平的高低與許多惡性腫瘤患者的預后密切相關［4］。盡管生物信息學分析提示miR-21對RECK基因的表達可能有調控作用，但兩者間的明確關系目前尚鮮見報道。因此，本研究擬通過在乳腺癌細胞MCF-7中上調和下調miR-21表達，觀察miR-21 對RECK表達的影響，明確miR-21對RECK表達的調控作用，為進一步研究miR-21調控的靶基因及其生物學機制提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 達爾伯克改良伊格爾培養基［Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM，賽默飛世爾生物化學制品（北京）有限公司］，胎牛血清（美國Invitrogen公司），胰酶（杭州吉諾生物醫藥技術有限公司），miR-21引物（蘇州吉瑪基因股份有限公司），Trizol試劑（美國 Invitrogen公司），Prime-Script反轉錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，SYBR?Premix［天根生化科技（北京）有限公司］，胰蛋白酶乙二胺四乙酸溶液（0.05%胰蛋白酶+ 0.1 mmol/L乙二胺四乙酸，美國HyClone公司），Lipofectamin2000轉染試劑（美國Invitrogen公司），聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置試劑盒（江蘇碧云天公司），蛋白標準品（德國Thermo公司），牛血清白蛋白（美國Sigma-Aldrich公司），細胞總蛋白裂解試劑盒（德國Thermo公司），Bradford法蛋白定量試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，miR-21抑制物、miR-21模擬物（上海吉瑪制藥技術有限公司），RECK一抗（美國ProteinTech公司），β-肌動蛋白一抗（美國Millipoer公司），異硫氰酸熒光素標志二抗（抗兔，美國Immunology Consultants Laboratory，Inc），X線片顯影液、定影液（上海冠龍照相器材公司）。超凈工作臺（美國Nuaire公司），6孔板、培養瓶、凍存管（美國Corning Incorporated公司），倒置顯微鏡（日本Olympus公司），BP61電子天平（德國Sartorius），二氧化碳（CO2）培養箱（美國Thermo Electron Corporation），AvantiTM30低溫高速離心機（美國Beckman公司），普通聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（德國Eppendorf公司），Engine Opticon 2熒光定量儀（美國MJ Research公司），VE-180垂直電泳槽（上海天能科技有限公司），VE-186轉移電泳槽（上海天能科技有限公司），DY-B1脫色搖床（上海滬西儀器廠）。

1.2方法

1.2.1細胞培養 MCF-7細胞株由本實驗室凍存細胞庫中復蘇培養。細胞用含10%胎牛血清的DMEM，在37℃、5%CO2培養箱常規培養，細胞鋪滿瓶底80%～90%時進行常規傳代。

磷酸鹽緩沖液漂洗后加入每瓶0.5 mL的0.25%胰酶，37℃孵育消化1min，用5mL沖洗培養基（DMEM 含5%胎牛血清）沖洗并終止消化，轉移至15 mL離心管中，1 200 r/min，4℃離心5 min。細胞懸液按5× 105/mL置于6孔板中培養，當細胞達到50%～70%融合時進行實驗。

1.2.2細胞轉染實驗

1.2.2.1干擾序列設計合成 采用化學合成的miR-21抑制物和miR-21模擬物分別用于抑制和上調MCF-7細胞的miR-21的表達，觀察其對MCF-7細胞RECK的影響。RNA單鏈寡核苷酸由蘇州吉瑪基因股份有限公司化學合成。

miR-21抑制物序列:5′-UCAACAUCAGUCUGA UAAGCUA-3′；抑制物陰性對照序列:5′-CAGUACUU UUGUGUAGUACAA-3′；miR-21模擬物序列:正義鏈5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反義鏈5′-AA CAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′；模擬物陰性對照序列:正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.2.2轉染效率檢測 轉染前1 d，取對數生長期細胞，胰酶消化，DMEM懸浮細胞至密度為1× 105/mL，鋪板于6孔板中，每孔1 mL，補加DMEM至2 mL，37℃、5%CO2培養箱中培養。培養24 h后，6孔板換培養基，采用Lipofectamin2000介導轉染miR-21抑制物，按照表1進行轉染。具體操作嚴格按照說明書進行，6 h后熒光顯微鏡下觀察結果并記錄。

表1　轉染劑量

1.2.2.3細胞轉染 在熒光顯微鏡下觀察，20 pmol轉染效率可達到70%以上，選擇20 pmol的miRNAs作為實驗用量。分別將miR-21抑制物、抑制物陰性對照、miR-21模擬物、模擬物陰性對照各組轉染到6孔培養板MCF-7細胞中，未經任何處理的為空白對照組。于37℃、5%CO2培養箱中培養，48 h后分別以Trizol試劑和蛋白裂解液提取細胞中總RNA和總蛋白。實時熒光定量PCR檢測干擾后細胞miR-21的表達水平，采用參照基因△Ct法分析，以U6看家基因表達PCR的Ct值作為相對標準，目的基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）相對表達水平計算公式:2-Δ（目的基因Ct-內參基因Ct）。

1.2.2.4蛋白質印跡法檢測轉染后MCF-7細胞內RECK表達水平 細胞轉染48 h后，在每孔細胞中加入全蛋白裂解液裂解細胞獲得蛋白，總蛋白樣品各20 μg和5×磷酸鹽緩沖液混勻后，100℃沸水煮5 min。裂解上清用二辛可寧酸試劑盒定量蛋白量，制備12%的分膠液，微量加樣器上樣20 μg總蛋白，300 mA轉膜90 min，5%脫脂奶粉/含吐溫-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris-buffered saline with Tween-20，TBST）室溫，搖床緩慢搖動，封閉60 min，洗膜3次，用稀釋比例為1∶1 000的RECK一抗孵育，4℃過夜，TBST洗膜3次、每次10 min。用辣根過氧化物酶標志的異硫氰酸熒光素標志二抗（抗兔）1∶5 000孵育，搖床緩慢搖動，室溫60 min。用TBST洗膜3次、每次10 min，暗室下電化學發光顯色、曝光，觀察結果。

將完成顯影的膠片掃描，以TIF格式儲存，Fluor Chem 8900軟件分析印跡條帶灰度，記錄平均灰度值。以目的蛋白RECK條帶平均灰度值/β-actin平均灰度值作為目的蛋白表達的相對高低值。

1.3統計學處理 應用SPSS 13.0軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間差異采用單因素方差分析，采用LSD進行多重比較，若方差不齊則采用Brown-Forsythe近似方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義，統計檢驗均為雙側概率檢驗。

2 結果

2.1miR-21轉染效率 轉染到細胞中帶綠色熒光標志的miR-21抑制物在細胞質中顯示綠色熒光，在用1 μL Lipofectamin2000轉染20 pmol miR-21抑制物時，效率即可達到70%左右（圖1）。

圖1　熒光標志檢測miR-21抑制物轉染效率（×200）

2.2細胞轉染后miR-21的表達 通過細胞轉染，抑制和上調MCF-7細胞的miR-21表達，轉染48 h后，miR-21抑制物組和miR-21模擬物組miR-21的表達分別與轉染空白對照組相比差異有統計學意義（F分別為30.79、139.68，P＜0.001），轉染miR-21抑制物組miR-21的表達明顯下降，轉染miR-21模擬物組miR-21的表達明顯上調（表2）。

2.3蛋白質印跡法檢測細胞轉染后RECK的表達miR-21抑制物組與抑制物陰性對照組比較，RECK表達明顯上升（F=93.76，P＜0.01）；miR-21模擬物組與模擬物陰性對照組比較，RECK表達明顯下降（F=82.63，P＜0.01）。蛋白質印跡法檢測相對表達量和條帶分別見表2和圖2。

表2　細胞轉染后miR-21及RECK表達（±s）

表2　細胞轉染后miR-21及RECK表達（±s）

注:與抑制物陰性對照組比較，*P＜0.001；與模擬物陰性對照組比較，#P＜0.001

組 別　miR-21　RECK抑制物空白對照組　1.12±0.16　1.00±0.00模擬物空白對照組　1.21±0.15　1.00±0.00抑制物陰性對照組　1.03±0.25　0.80±0.03模擬物陰性對照組　1.14±0.61　1.02±0.33 miR-21抑制物組　0.02±0.01*　1.42±0.94*miR-21模擬物組　106.79±18.59#　0.74±0.03#

圖2　干擾miR-21表達后細胞RECK表達（±s，n=3）

3 討論

乳腺癌是女性高發的惡性腫瘤之一，遠處轉移是患者致死的最重要原因。乳腺癌的轉移是一個多基因參與、通過多步驟完成的復雜過程，其具體機制尚未明確。miRNAs是近年發現的一類長度約22個核苷酸非編碼小分子RNA，通過靶mRNA降解或抑制其翻譯來調節靶基因的表達，在細胞的分化、增殖、遷移、侵襲和轉移、個體發育、機體代謝，以及腫瘤、病毒感染多種疾病中都具有重要作用［5］。

RECK基因是新發現的一種膜表面糖蛋白，該基因位于9p13-p12。研究證實，RECK基因的表達與胃癌、食管癌、乳腺癌的預后具有相關性，RECK基因表達陰性的預后較差，反之RECK基因表達陽性的預后較好［6］。因此，RECK是一種抑癌基因，可負向調控腫瘤的轉移或侵襲。

miRNAs調控基因表達的機制之一是通過與靶基因mRNA的3′端非翻譯區相結合，通過降解靶基因mRNA起到生物學調節功能的作用。作者通過在線的生物信息學預測軟件，發現miR-21 5′端的種子序列可以與RECK 3′-非翻譯區靶向互補，因此推測RECK可能是miR-21調節的靶基因之一。有研究表明，RECK基因表達水平與乳腺癌細胞侵襲力存在相關性，RECK基因的表達可以作為乳腺癌患者預后的一個指標［7］。基于RECK基因在腫瘤組織的表達可以影響腫瘤侵襲、轉移和血管生成，所以影響RECK基因的表達，有望成為在預防和治療腫瘤侵襲和轉移的新靶點。

miR-21在多種實體腫瘤及非實體腫瘤中均呈現高表達，在乳腺癌中也不例外［8-9］。越來越多的研究發現，miR-21不僅在腫瘤發生中起類似癌基因的作用，更重要的是其參與腫瘤的侵襲和轉移。Yan等［10］發現乳腺癌中miR-21高表達，且與乳腺癌的臨床病理特征如分期、淋巴結轉移顯著相關。Petrovic′等［11］也發現高侵襲性乳腺癌患者miR-21呈現高表達，miR-21的高表達有可能成為乳腺癌高侵襲性的獨立分子標志物，且miR-21高表達與乳腺癌臨床分期、淋巴結轉移、浸潤等惡性行為具有正相關性，因而進一步研究miR-21如何通過分子調節機制來對乳腺癌的侵襲起預測作用。

欣喜的是在TargetScan中發現miR-21 5′端的種子序列可以與RECK 3′-非翻譯區靶向互補，RECK基因有可能是miR-21調節的靶基因之一。本實驗通過設計miR-21模擬物、miR-21抑制物、模擬物陰性對照、抑制物陰性對照各組瞬時轉染到MCF-7細胞中，48 h后通過熒光定量PCR檢測miR-21在細胞的表達情況，發現轉染miR-21抑制物組miR-21的表達明顯下降，轉染miR-21模擬物組miR-21的表達明顯上調。確認細胞中miR-21干擾表達成功后，提取細胞蛋白，通過蛋白質印跡法檢測細胞轉染后RECK的表達，發現miR-21抑制物組RECK表達有明顯上調趨勢，miR-21模擬物組RECK表達明顯下降趨勢。因此，有理由推斷，RECK基因有可能是miR-21調節的靶基因之一，miR-21可以作為乳腺癌診斷預后分析的標志物，也可能成為治療的新靶點之一。

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MicroRNA-21 regulates expression of reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs in MCF-7 cells

ZHENG Zhiwei1，ZHAO Shulin1，YANG Yuxian2，ZHU Huide1，ZHU Zhiwei1，CHEN Lei2
（1.Department of Pharmacy，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China；2.Department of Gastroenterology，Cancer Hospital of Shantou University Medical College，Shantou Guangdong 515041，China）

R737.9

A

2095-3097（2016）04-0198-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2016.04.002

汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院青年科研基金資助項目（2013A004）；廣東省乳腺癌診治研究重點實驗室種子基金資助項目（2012A061400018）；汕頭市科技計劃資助項目（汕市財教〔2013〕244號）

515041廣東汕頭，汕頭大學醫學院附屬腫瘤醫院藥學部（鄭志偉，趙樹林，朱輝德，朱志偉），消化腫瘤內科（楊鈺賢，陳 蕾）

陳 蕾，E-mail:zhiweizheng@126.com

（2016-04-11 本文編輯:徐海琴）