煙草根系分泌物酚酸類物質的鑒定及其對根際微生物的影響

劉艷霞, 李 想, 蔡劉體, 張 恒, 石俊雄

(貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000)

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煙草根系分泌物酚酸類物質的鑒定及其對根際微生物的影響

劉艷霞, 李 想, 蔡劉體, 張 恒, 石俊雄*

(貴州省煙草科學研究院，貴陽 550000)

【目的】煙草連作已導致土傳病害發生、煙株生長受抑制、產量下降和品質惡化等問題。煙株對自身及土壤微生物產生的化感作用，是煙草產生連作障礙的一個重要原因，其中化感物質中的根系分泌物是煙株與土壤微生物間相互作用的重要物質，探索煙草根系分泌物對根際微生物生長的影響是生物防控煙草青枯病的理論依據。【方法】本文利用超高效液相色譜串聯四級桿飛行時間質譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術，分離、鑒定煙草根系分泌物中主要酚酸類物質的種類和含量; 通過添加外源酚酸類物質，研究在液體培養基中煙草根系分泌物中的主要酚酸類物質對病原菌及拮抗菌的影響，并在土壤中添加鑒定出的主要酚酸類物質; 通過土壤培育試驗，研究其對土壤微生物多樣性和數量變化，特別是對煙草青枯病菌及其拮抗菌生長的影響。【結果】1)煙草根系分泌物粗提物對病原菌(茄科勞爾氏菌)生長的促進率為16.8%，對拮抗菌(短短芽孢桿菌)的生長抑制率達到29.4%; 2)UPLC-Q-TOF/MS檢測根系分泌物中主要酚酸類物質為苯甲酸和3-苯丙酸，含量分別為0.25μg/g干根重和1.15μg/g干根重; 3)液體培養外源添加低濃度的苯甲酸(≤ 2μg/L)和3-苯丙酸(≤ 3μg/L)促進病原菌和拮抗菌的生長; 4μg/L的苯甲酸對病原菌生長抑制作用不顯著，對拮抗菌生長的抑制率達到90.2%，6μg/L的 3-苯丙酸對病原菌的生長具有促進作用，對拮抗菌的生長抑制率達到81.1%，外源高濃度苯甲酸(≥4μg/L)和3-苯丙酸(≥ 7μg/L)抑制病原菌與拮抗菌的成長; 4)土壤中添加3μg/kg土的苯甲酸時，土壤中病原菌的數量增加12.3%，而拮抗菌的數量減少21.0%，土壤細菌、放線菌和真菌的數量分別降低37.5%，41.9%和55.6%; 3-苯丙酸濃度達到8μg/kg土時，拮抗菌生長量減少14.5%，對病原菌沒有顯著影響，土壤細菌、放線菌和真菌的數量分別降低69.9%，57.2%和80.7%; 5)土壤添加4μg/kg的苯甲酸和7μg/kg的3-苯丙酸后，土壤微生物Shannon指數、Simpson指數、McIntosh指數顯著下降，分別僅為對照的57.7%、94.1%、88.1%和97.6% 73.3%、80.0%。【結論】煙草根系分泌物粗提物促進病原菌生長抑制拮抗菌生長，根系分泌物中酚酸類物質主要為苯甲酸和3-苯丙酸，液體培養中4μg/L的苯甲酸或6μg/L的 3-苯丙酸濃度是對病原菌生長抑制不明顯但顯著抑制拮抗菌生長的分界點，土壤外源添加3μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸時，是土壤增加病原菌減少拮抗菌數量的分界點，同時土壤微生物功能多樣性顯著下降，病原菌對根系分泌物中苯甲酸和3-苯丙酸的利用優于拮抗菌，這也是煙草長期連作引起青枯病暴發流行的機理之一。

煙草根系分泌物; 病原菌; 拮抗菌; 根際微生物; 土壤微生物群落功能多樣性

soilmicrobialfunctionaldiversity

煙草作物的氣候性較強，對地理環境和栽培條件要求較高，因此煙草種植有明顯的地域性特點，在貴州省甚至全國煙葉生產中，連作現象非常普遍。單一作物連作導致根系分泌物在土壤中不斷積累，從而對作物和土壤微生物產生化感作用[1]。酚酸類物質是根系分泌物中非常重要的化感物質，對植物的自毒作用也是導致連作障礙發生的重要因素[2]。前期研究通過GC、HPLC、GC/MS等分離鑒定手段己經得到了多種酚類化感物質，如氫氰酸、苯甲酸、肉桂酸和皂角昔等物質都對土壤微生物生長起抑制作用或促進病原菌的生長繁殖[3]，從而誘導土傳性病害的發生。本研究表明，長期連作一種作物會導致根際形成單一的土壤環境，根系分泌物作為土壤中的碳、氮物質，為病原菌生長繁殖提供營養，同時也抑制了一些根際有益微生物的生長，從而在土壤中形成一種不平衡的微生態環境，導致土傳病害的暴發流行[4-5]。近年來，對于根系分泌物的研究主要側重在小麥[6]、水稻[7]、西瓜[8]和黃瓜[9]等作物上，而對煙草根系分泌物相關研究較少。且現有研究主要集中在煙草根系粗提物的極性分離，以及不同極性的根系粗提物對煙苗生長、土壤酶活性等的影響[10]。

本研究通過鑒定、分析煙草根系分泌物中主要酚酸類物質種類和含量，研究根系分泌物對煙草青枯病菌、拮抗菌生長及根際微生物多樣性的影響，旨在探索根系分泌物與煙草連作后造成的煙草青枯病害暴發的相關性。

1　材料與方法

1.1煙草青枯病菌茄科勞爾氏菌及其拮抗菌的分離、篩選與鑒定

圖1　共培養法觀測Ralstonia solanacearum(左)、拮抗菌Brevibacillus brevis(右)的菌落形態Fig.1　The colony morphology of R. solanacearum (left) and the antagonist (right) tested by co-cultureing R. solanacearum.

在培育45d后，先用自來水沖洗煙苗根系5次，再用去離子水沖洗5次。煙草根系浸泡在6L超純水中于恒溫恒濕人工氣候室中培育36h，期間用電磁泵向水中補充氧氣以維持煙株正常生長。根系分泌物收集液經0.45μm微孔過濾膜過濾后立即凍干濃縮并保存于-20℃條件下。根系分泌物凍干粉末溶解于滅菌去離子水中，分別配成0.01g/mL用于生物測定及1g/mL用于成分分析。總碳和總氮含量由Elementar元素分析儀測定(VarioELcube，德國)，經測定，根系分泌物母液粗提物中總碳含量為38.94%，總氮含量為4.62%。

1.3煙草根系分泌物對病原菌與拮抗菌生長的影響

茄科勞爾氏菌在改良的Kelman’sTTC瓊脂培養基(10g葡萄糖、5g蛋白胨、3g牛肉浸粉和0.5g酵母粉，定容至1L水中，pH調節至7.0)上培養[19]，篩選到的拮抗菌在牛肉膏蛋白胨培養基上培養[20]。每種微生物各設置兩個處理，共4個處理: 1)茄科勞爾氏菌在改良后的Kelman’sTTC培養基上培養(CKR); 2)茄科勞爾氏菌在1 ∶1 (v∶v) 改良后的Kelman’sTTC培養基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養(RR); 3)拮抗菌短短芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養基上培養(CKB); 4)拮抗菌短短芽孢桿菌在1 ∶1 (v∶v) 牛肉膏蛋白胨培養基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養(RB)。所有處理于30℃、170r/m培養48h。茄科勞爾氏菌與拮抗菌的生長速率通過分光光度計對OD600進行測定。

根系分泌物對微生物生長速率的影響=[(ROD600-CKOD600)/CKOD600]×100%式中: ROD600表示在1 ∶1 (v∶v)培養基和0.01g/mL，rootDW根系分泌物溶液中培養后微生物OD600值; CKOD600表示微生物直接在培養基中培養后的OD600值。

1.4UPLC-Q-TOF/MS分析酚酸標準品和根系分泌物中的酚酸類物質

五倍子酸、原兒茶酸、2,5-二羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸和4-羥基苯甲醛從AlfaAesar公司購買 (WardHill,MA,USA)，香草酸、對香豆酸、紫丁香酸、阿魏酸、苯甲酸、3-苯丙酸和肉桂酸購自Sigma-Aldrich公司(Steinem,Germany)。通過對比標準品和根系分泌物中主要物質的出峰時間和峰面積鑒定根系分泌物中主要酚酸類物質及其含量[21]，并通過分析質譜圖，確定各組分的分子組成。前期用半制備高效液相色譜儀(Aglient1200, 德國)分離根系分泌物中主要酚酸類物質，分離度較好(圖2)。兩個主要色譜峰出現在保留時間60min和60.5min，與標準品峰圖比對后，初步確定這兩個峰分別為苯甲酸和3-苯丙酸(圖2)。

圖2　酚酸標準品(左)和煙草根系分泌物(右)液相色譜圖Fig.2.　HPLC chromatograms of standard phenolic acids (left) and tobacco root exudates (right)

[注(Note): 1—五倍子酸Gallicacid; 2—原兒茶酸Protocatechuicacid; 3—2,5-二羥基苯甲酸2, 5-dihydroxybenzoicacid; 4—4-羥基苯甲酸4-hydroxybenzoicacid; 5—4-羥基苯甲醛4-hydroxybenzaldehyde; 6—香草酸Vanillicacid; 7—對香豆酸P-coumaricacid; 8—紫丁香酸Syringicacid; 9—阿魏酸Ferulicacid; 10—苯甲酸Benzoicacid; 11—3-苯丙酸3-phenylpropanoicacid; 12—肉桂酸Cinnamicacid.]

1.5外源添加酚酸類物質對病原菌和拮抗菌生長的影響

將UPLC-Q-TOF/MS中分離、鑒定的主要酚酸類物質以外源添加的方式研究其對煙草青枯病菌和拮抗菌生長的影響。15μg苯甲酸溶解于60℃滅菌后的去離子水中，作為母液1。0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和10.0μg/L濃度的苯甲酸溶液分別由母液1稀釋獲得; 0.3mg3-苯丙酸溶于10mL滅菌后去離子水中，作為母液2。0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0μg/L濃度的3-苯丙酸分別由母液2稀釋獲得。研究不同濃度的苯甲酸溶液和3-苯丙酸溶液對青枯病病原菌和拮抗菌生長的影響方法同上。每處理重復5次。

1.6添加外源酚酸類物質對土壤病原菌和拮抗菌數量的影響

從青枯病發病嚴重的大田采集土壤并接種拮抗菌，在貴州省煙草科學研究院實驗室中進行土壤培育實驗。將分離、鑒定的根系分泌物中主要酚酸類物質以外源添加的方式施加于土壤中，苯甲酸濃度調整至3、4和5μg/kg土，3-苯丙酸濃度調整至6、7和8μg/kg土，向土壤中接種滅菌去離子水為對照，每處理5次重復。將土壤置于恒溫培養箱中在28℃和60% 相對濕度下培養3d。用熒光定量PCR法測定土壤中病原菌和拮抗菌的數量[14]。

1.7添加外源酚酸類物質對土壤根際微生物的影響

根際土壤微生物功能多樣性用BiologEcoPlate系統 (BiologInc.HaywardCal.USA)通過比較31種碳源利用情況測定[22]。土壤懸液在4℃、3000×g轉速下離心5min，然后用0.85%的NaCl溶液稀釋100倍。土壤稀釋液接種于EcoPlates，在Biolog恒溫(25℃)培養箱中暗培養72h。EcoPlates上每孔顏色變化度為OD值與對照OD值之差[23]。微生物活性用微孔板平均顏色變化度(AWCD)值表示，Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數表征土壤微生物功能多樣性。

ShannonIndex=-∑PilnPi

式中，Pi=Ai/Atotal;ni=Ai;N=Atotal;A代表590nm處吸光度。

1.8數據處理

試驗數據采用MicrosoftExcel2003進行處理，顯著性分析采用SPSSBaseVer.13.0統計軟件 (SPSS,IL,Chicago,USA)，LSD、Duncan新復極差法進行多重比較(P≤0.05)。

2　結果與分析

2.1煙草根系分泌物粗提物對病原菌與拮抗菌生長的影響

根系分泌物溶液能夠顯著促進病原菌(茄科勞爾氏菌)的生長，同時對拮抗菌(短短芽孢桿菌)生長具有抑制作用。從表1可以看出，與對照相比，添加根系分泌物母液粗提物后促進了病原菌生長，增幅達到16.8%，對拮抗菌的生長抑制率達到29.4%。2.2根系分泌物中主要酚酸類物質鑒定與含量測定

目前根據酚酸的峰面積，只鑒定出兩種含量較高的酚酸類物質，其他峰有待于進一步鑒定。在酚酸標準品液相色譜圖中，苯甲酸和3-苯丙酸的出峰時間分別為10.11min和12.92min，通過對比根系分泌物和酚酸標準品液相色譜圖的出峰時間，在根系分泌物UPLC色譜圖中10.10min和12.92min處分別為苯甲酸和3-苯丙酸(圖3)。從表2可以看出，在負離子模式下，從根系分泌物中分離鑒定出的兩種主要物質m/z分別為121.0289和149.0599，與理論值分別相差1.0和4.0ppm，驗證兩種物質分別為苯甲酸和3-苯丙酸。經過UPLC峰面積對比，苯甲酸在煙草根系分泌物中的含量為0.25μg/g干根重，3-苯丙酸在煙草根系分泌物中的含量為1.15μg/g干根重。

表1　煙草根系分泌物對病原菌和拮抗菌生長的影響

圖3　酚酸標準品(上)和煙草根系分泌物(下)UPLC色譜圖Fig.3　UPLC of standard phenolic acids (upper) and substances in tobacco root exudates (lower)

峰號PeakNo.負離子模式Negativeionmode檢測值(m/z)Obs.mass化學式Chemicalformula理論值(m/z)Theor.massΔm(ppm)鑒定化合物Tentativeassignment1149.0599C9H10O2149.06034.03-phenylpropanoicacid2121.0289C7H6O2121.02901.0Benzoicacid

2.3添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對液體培養病原菌和拮抗菌的影響

當外源添加苯甲酸濃度≤3μg/L時，苯甲酸能促進病原菌(茄科勞爾氏菌)的生長，分別比對照處理增加了5.9%(1μg/L)、5.2%(2μg/L)和2.6%(3μg/L); 外源添加4μg/L濃度苯甲酸時，病原菌濃度與對照處理之間無顯著差異; 超過5μg/L濃度苯甲酸時，病原菌生長受到明顯抑制(表3); 當外源添加苯甲酸小于等于2μg/L時促進拮抗菌(短短芽孢桿菌)的生長，促進率隨苯甲酸溶液濃度的增加而減小; 當苯甲酸濃度超過2μg/L后拮抗菌的生長受到抑制，對拮抗菌生長的抑制率達到16.6%(3μg/L)和90.2%(4μg/L)，超過5μg/L后拮抗菌幾乎無法生長。5μg/L濃度的苯甲酸溶液對茄科勞爾氏菌和短短芽孢桿菌的抑制作用分別達到99.7%和99.9%。病原菌和拮抗菌在10μg/L的苯甲酸溶液中完全不能生長。

當外源添加3-苯丙酸濃度小于等于6μg/L時，病原菌的生長得到促進，分別比對照處理增加10.6%(1μg/L)、10.1%(2μg/L)、8.4%(3μg/L)、6.7%(4μg/L)、5.2%(5μg/L)和1.3%(6μg/L)，超過8μg/L濃度時，病原菌的生長受到顯著影響，幾乎不生長(表3)。當外源添加3-苯丙酸濃度小于等于3μg/L時，促進拮抗菌的生長，分別比對照處理增加4.2%(1μg/L)、1.3%(2μg/L)和1.2%(3μg/L)，超過4μg/L時拮抗菌生長受到抑制，分別比對照處理減少31.1%(4μg/L)和37.7%(5μg/L); 7μg/L濃度的3-苯丙酸對拮抗菌的生長具有強烈的抑制作用，拮抗菌幾乎都不能存活。

2.4添加外源酚酸類物質對土壤病原菌和拮抗菌數量的影響

表3　不同濃度苯甲酸和3-苯丙酸對病原菌和拮抗菌生長的影響(OD600)

注(Note):NA—未得到的數據Meansnotavailable. 同列數據后不同字母表示處理間差異達5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

圖4　添加外源苯甲酸對土壤病原菌和拮抗菌數量的影響Fig.4.　The effect of exogenous benzoic acid on the population of R. solanacearum and B. brevis

[注(Note): 柱上不同小寫字母表示病原菌處理間差異達5%顯著水平，不同大寫字母表示拮抗菌處理間差異達5% 顯著水平Differentsmalllettersabovethebarsmeansignificantatthe5%levelsamongtreatmentsofpathogen,andcapitallettersmeansignificantatthe5%levelsamongtreatmentsofantagonist.]

2.5添加外源苯甲酸和3-苯丙酸對土壤根際可培養微生物數量和微生物群落功能多樣性的影響

4μg/kg的苯甲酸和8μg/kg的3-苯丙酸顯著降低土壤微生物數量(表4、表5)。當苯甲酸的濃度為4μg/kg、5μg/kg時，土壤細菌、放線菌和真菌的數量分別降低85.2、92.6%、60.7, 76.9%和86.2、92.2%。隨著3-苯丙酸濃度的增加，盡管土壤微生物數量稍有下降趨勢，但處理間無顯著差異。當3-苯丙酸濃度達到8μg/kg時，與對照相比，土壤微生物數量顯著下降。4μg/kg的苯甲酸或7μg/kg的3-苯丙酸是土壤微生物多樣性和均勻度顯著下降的轉折點，添加4μg/kg的苯甲酸土壤Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數分別僅為對照的57.6%、88.1%和73.3%，添加7μg/kg的3-苯丙酸土壤Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數分別僅為對照的94.1%、97.6%和80.1%。

圖5　添加外源3-苯丙酸對土壤病原菌和拮抗菌數量的影響Fig.5.　The effect of exogenous 3-phenylpropanoic acid on the population of R. solanacearum and B. brevis

[注(Note): 柱上不同小寫字母表示病原菌處理間差異達5%顯著水平，不同大寫字母表示拮抗菌處理間差異達5%顯著水平Differentsmalllettersabovethebarsmeansignificantatthe5%levelamongtreatmentsofpathogen,andcapitallettersmeansignificantatthe5%levelamongtreatmentsofantagonist.]

表4　添加外源苯甲酸后土壤細菌、放線菌和真菌的數量和微生物群落功能多樣性

注(Note): 同列數據后不同字母表示處理間差異達5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

表5　添加外源3-苯丙酸后土壤細菌、放線菌和真菌的數量和微生物群落功能多樣性

注(Note): 同列數據后不同字母表示處理間差異達5%顯著水平Valuesfollowedbydifferentlettersinacolumnaresignificantamongtreatmentsatthe5%level.

3　討論

近年來研究表明，化感物質不但引起作物自毒作用，同樣會導致病害的暴發流行[24]。目前，研究煙草根系分泌物的種類和含量，以及主要酚酸類物質對根際微生物特別是對土傳病害病原菌和拮抗菌生長影響方面的系統研究還較少，并主要集中在根系粗提物的極性分離，以及不同極性的根系粗提物對煙苗生長、土壤酶活性等的影響方面[8]。植物賴以生存的土壤中聚集著大量微生物，其中既有有益微生物，也有病原微生物。根系分泌物中豐富的糖類、氨基酸類、有機酸及酚酸等物質，為植物根際土壤微生物的生長和繁殖提供了充足的營養，同時也影響著土壤微生物的種類、數量及其在植物根際的分布。研究發現，不同土壤微生物在根際的定殖受根系分泌物的影響而表現出明顯的根際效應[25-26]。而且，根系分泌物還對根際微生物的生長和發育產生影響。韓雪等[5]研究不同黃瓜品種的根系分泌物對黃瓜枯萎病菌孢子萌發、菌絲生長及病原菌生物量的影響時發現，抗枯萎病黃瓜品種的根系分泌物對上述指標均有明顯的抑制作用，而感病品種則相反。韓麗梅等[27]研究大豆連作土壤中有機物對大豆根腐病菌的影響時發現，土壤中酚酸組分對尖孢鐮刀菌等三種病菌的生長多表現出顯著的促進作用; 同時，根系分泌物中的有機酸與酚酸類物質使連作土壤理化特性改變，引發根際土壤pH值降低，也對根際土壤微生物種群結構的變化產生較大影響，因此長期連作導致土傳病害的暴發流行[28]。根系分泌物中的酚類與酚酸類物質在作物自毒現象和連作障礙中扮演非常重要的角色，多種酚酸類物質對植物的生長發育都起到抑制的作用[29-31]。本試驗以煙草根系分泌物中的酚酸類物質為主要研究對象，在煙草根系分泌物中分離、篩選鑒定到兩種主要酚酸類物質(苯甲酸和3-苯丙酸)，補充了煙草根系分泌物已有的關于其他酚酸類物質的研究內容。

不同濃度的酚酸對微生物生長繁殖起著不同的作用。馬瑞霞等研究[32]指出，當反式-阿魏酸的濃度分別達到5.149, 2.575和0.257mmol/L時，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的生長和反硝化作用受到顯著影響; 而當苯甲酸的濃度為4.09 和8.189mmol/L時，枯草芽孢桿菌生長得到顯著促進。高欣欣等[33]分離并鑒定烤煙根系分泌物中存在苯甲酸、肉桂酸、反丁烯二酸和琥珀酸等，并分析測定了這些酚酸類物質對煙草種子和出芽的化感作用，研究表明，苯甲酸能夠顯著抑制煙苗的生長、種子萌發及煙葉品質，濃度越高抑制作用越強。本試驗探索了不同種類、不同濃度的酚酸類物質對病原菌和兩株拮抗菌生長的影響，結果表明，低濃度的苯甲酸和3-苯丙酸能夠促進病原菌和拮抗菌的生長，而高濃度則同時抑制這兩種微生物的生長。另外，苯甲酸對病原菌的抑制濃度大于拮抗菌，這可能是由于不同微生物對酚酸類物質濃度的響應不同造成的; 譚秀梅等[34]的研究也得到類似的結果，即隨著外源物質濃度的升高，土壤微生物數量具有先增加后降低的趨勢。Qu等[35]研究表明，2,4-二叔丁基苯酚和香草酸的加入對微生物量同樣存在低濃度促進、高濃度抑制的作用。郝文雅等[36]發現西瓜根系分泌物能夠增加尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)孢子萌發的數量，并增強其繁殖能力。本試驗中計算得到根系分泌物中的苯甲酸含量為0.25μg/g干根重，而在田間實際生產中，正常的煙株旺長期的根干重約為12g左右[37]，即每株煙旺長期的苯甲酸分泌量約為3μg/kg根際土。試驗結果中3μg/kg的苯甲酸對土壤中的病原菌生長具有促進作用，但對拮抗菌的生長卻起到抑制作用，表明田間實際生產中，煙株正常分泌的苯甲酸對病原菌具有正向趨向作用，而對拮抗菌卻具有排斥作用。3-苯丙酸在煙草根系分泌物中的含量為1.15μg/g干根重，每株煙旺長期的3-苯丙酸分泌量為13.8μg/kg，超出試驗中設置的最大量8μg/kg的3-苯丙酸，可能會同時抑制土壤中的病原菌和拮抗菌的生長。根系分泌物中含有多種物質，可能會對濃度較高的某一種物質具有緩沖性，而單一添加3-苯丙酸時，這種緩沖作用消失，有可能造成比理論分界點偏低的現象。

在本研究中，4μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸可以顯著減少土壤微生物包括細菌、放線菌和真菌的數量。根際微生物的活性與根系分泌物的種類和數量密切相關，根系分泌物對根際土壤中的微生物種類及數量有著特異性和非特異性的影響，在多數情況下，根系分泌物對根際微生物的影響是非特異性的，它對微生物物趨向有著誘導的作用。革蘭氏陰性無芽孢細菌會受到根系分泌物的誘導向根際聚集[38]。Sushma[39]的研究表明，根際促生菌熒光假單胞桿菌(Pseudomonas fluorescens)會受到番茄根系分泌物中主要成分檸檬酸和蘋果酸的誘導定殖，即趨化現象。本試驗中的茄科勞爾氏菌屬于革蘭氏無芽孢細菌，而拮抗菌Brevibacillus brevis為革蘭氏陽性菌，因此，煙草根系分泌物對病原菌的誘導性遠遠大于對拮抗菌的誘導性，使得病原菌比拮抗菌更易定殖在煙株根際。

根系分泌物對根際土壤的微生物多樣性和豐富度作用顯著[40]，根系分泌物調節并決定著根系與土壤微生物間的生物、化學、物理等相關關系，在根系-微生物互作過程中起著至關重要的作用[41-42]。化感作用通過改變根際土壤中微生物的數量和群落結構間接影響微生態平衡[43-44]，調控病原菌的生長與致病性。特定的根系分泌物決定著土壤中主要的微生物群落種類，在連作條件下，土壤微生物群落多樣性降低，有益微生物減少甚至滅亡，病原微生物增加[9]。柯文輝[45]認為在煙草連作障礙土壤中存在化感自毒物質，隨著這些自毒物質逐漸積累，可以顯著降低土壤微生物群落多樣性，增加病原微生物數量，破壞土壤微生態系統的平衡，降低根系的代謝活動及營養元素的有效性，最終導致煙葉產量和質量下降。本試驗中當苯甲酸的濃度為4μg/kg、5μg/kg時，土壤細菌、放線菌和真菌的數量分別降低了85.2%、92.6%，60.7%和76.9%、 86.2%、92.2%。在一定濃度下，隨著3-苯丙酸濃度的增加，盡管土壤微生物濃度稍有下降趨勢，但處理間無顯著差異。當3-苯丙酸濃度達到8μg/kg時，與對照相比，土壤微生物數量顯著下降。土壤的微生物活性分別由Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數表征，反映土壤微生物功能多樣性。4μg/kg的苯甲酸或7μg/kg的3-苯丙酸是土壤微生物多樣性和均勻度顯著下降的轉折點。當土壤中接種低濃度的苯甲酸和3-苯丙酸時，土壤微生物對BiologECO板中的底物利用率較高。與液體培養基不同的是，土壤能夠緩沖酚酸類物質對微生物的抑制作用。因此，土壤接種苯甲酸和3-苯丙酸后對土壤微生物生長的抑制濃度略大于液體培養基。

4　結論

通過UPLC-Q-TOF/MS，在煙草根系分泌物中分離、篩選到兩種主要酚酸類物質為苯甲酸和3-苯丙酸; 液體培養條件下，對茄科勞爾氏菌具有促進作用的酚酸濃度分別為3μg/L苯甲酸和6μg/L3-苯丙酸，顯著高于對拮抗菌短短芽孢桿菌有促進作用的酚酸濃度; 土壤外源添加3μg/kg的苯甲酸或8μg/kg的3-苯丙酸時，土壤病原菌數量增加而拮抗菌數量減少，同時土壤微生物功能多樣性降低; 與拮抗菌相比，煙草青枯病病原菌可以更好地利用煙草根系分泌物中的酚酸類物質，從而比拮抗菌更易定殖于煙株根際，這可能是連作障礙造成土傳病害暴發流行的機理之一。

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Identificationofphenolicacidsintobaccorootexudatesandtheirroleinthegrowthofrhizospheremicroorganisms

LIUYan-xia,LIXiang,CAILiu-ti,ZHANGHeng,SHIJun-xiong﹡

(Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550000, China)

【Objectives】Tobaccocontinuousmono-croppinghascausedveryseriousproblems,includingsoil-bornediseaseoutbreak,tobaccogrowthsuppression,yieldreductionandqualitydecline.Allelopathycomesfromtobaccoandsoilmicroorganismsmaybeoneofthemostimportantreasonsleadingtomono-croppingobstacle.Tobaccorootexudates(TRE)playakeyroleintheplant-microorganisminteractionsintherhizosphere.Itisofgreatimportancetoexploreeffectoftobaccorootexudatesonrhizospheremicroorganisms. 【Methods】Inthisstudy,themainphenolicacidswerescreenedandidentifiedbytheUPLC-Q-TOF/MSmethod,andtheircontentsintobaccorootexudateswereevaluated.EffectofidentifiedphenolicacidsfromTREinliqiudmediumonpathogenanditsantagonistwasinvestigatedbyapplyingexogenousphenolicacids.Besides,thesoilwasaddedwiththeidentifiedphenolicacidsandculturedfor3d.Afterthat,therhizospheremicrobialdiversitiesandcounts,especiallythepopulationofpathogenRalstonia solanacearumanditsantagonistBrevibacillus brevisinthesoilweremeasured. 【Results】 1)Thetobaccorootexudatespromotethegrowthofpathogenby16.8%andsuppressthegrowthofantagonistby29.4%. 2)TwophenolicacidsarescreenedandidentifiedbyUPLC-Q-TOF/MSwiththeconcentrationsof0.25μg/gand1.15μg/gdryroot,respectively. 3)Whentheexogenousphenolicacidswereaddedtotheculturemedia,lowconcentrationsofbenzoicacid(≤2μg/L)and3-phenylpropanoicacid(≤3μg/L)promotethegrowthofthepathogenandantagonist,andthe4μg/LbenzoicaciddoesnotsignificantlyaffectR. solanacearum,whereasthepopulationofantagonistisdecreasedby90.2%.The6μg/L3-phenylpropanoicacidpromotesthegrowthofthepathogenwhileinhibitsthegrowthofantagonistby81.1%.Highconcentrationsofbenzoicacid(≥ 4μg/L)and3-phenylpropanoicacid(≥ 7μg/L)significantlysuppressthepathogenandantagonist. 4)Whenthesoilisappliedwiththe3μg/kgbenzoicacid,thepathogencountwasincreasedby12.3%whiletheantagonistpopulationisdecreasedby21.0%.Besides,thepopulationsofsoilbacteria,actinomycetesandfungiaredeclinedby37.5%，41.9%and55.6%,respectively.The8μg/kg3-phenylpropanoicacidsignificantlysuppressestheantagonistgrowthby14.5%,anddoesnotsignificantlyaffectthepathogen.Soilbacteria,actinomycetesandfungiaredecreasedby69.9%, 57.2%and80.7%,respectivelyunderthisconcentrationof3-phenylpropanoicacid. 5)Afterthe4μg/kgbenzoicacidor7μg/kg3-phenylpropanoicacidapplicationtothesoil,theShannonindex,SimpsonindexandMcIntoshindexaresignificantlydeclinedto57.7%, 88.1%, 73.3%and94.1%, 97.6%, 80.0%ofCK. 【Conclusions】Thetobaccorootexudatespromotethepathogengrowthwhereassuppresstheantagonistgrowth.Themainphenolicacidsintobaccorootexudatesarebenzoicacidand3-phenylpropanoicacid.The4μg/Lexogenousbenzoicacidor6μg/Lexogenous3-phenylpropanoicacidaretheboundaryconcentrations,whichdonotsignificantlysuppressthegrowthofpathogenbutinhibitstheantagonist.Whenbenzoicacidand3-phenylpropanoicacidareappliedtothesoil,thegrowthofpathogenispromoted,whiletheantagonistpopulationandtherhizo-microbialfunctionaldiversityaresignificantlyreducedunderthe3μg/kgbenzoicacidor8μg/kg3-phenylpropanoicacid.Pathogencouldsurviveundertheconditionoftobaccorootexudates,ratherthanantagonist.Thismaybeanexplanationoftobaccobacterialwiltoutbreakresultedfrommono-croppingobstacle.Keywords:tobaccorootexudates;pathogen;antagonist;rhizospheremicroorganism;

2014-10-28接受日期: 2014-12-30網絡出版日期: 2015-07-21

國家自然科學基金(41461068); 公益性行業(農業)科研專項(201103004); 中國煙草總公司重點項目(110201002019); 貴州省煙草總公司重點項目(201410); 貴州省科學技術基金項目(黔科合J字[2013]2197號和2198號)資助。

劉艷霞(1982—)，女，河北張家口人，博士，副研究員，主要從事植物營養、土壤微生物區系分析等研究。

E-mail:liuyanxia306@163.com。*通信作者E-mail:sjx2196@163.com

S572.01;S154.37

A

1008-505X(2016)02-0418-11