HPV-16感染對喉咽鱗癌組織及FaDu細胞miRNA表達的影響

路武豪郭文濤馮 龍婁衛華*（ 鄭州大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 45005； 廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 5808； 河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科，河南 鄭州 450008）

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HPV-16感染對喉咽鱗癌組織及FaDu細胞miRNA表達的影響

路武豪1郭文濤2馮 龍3婁衛華1*
（1 鄭州大學第一附屬醫院耳鼻喉科，河南 鄭州 450052；2 廣東醫科大學基礎醫學院，廣東 東莞 523808；3 河南中醫學院基礎醫學院病原生物學與免疫學科，河南 鄭州 450008）

目的 探討HPV-16感染對喉咽鱗癌組織及FaFu細胞miRNA表達的調控。方法 收集28例人喉咽鱗癌新鮮組織標本，PCR-反向點雜交法檢測標本中HPV DNA的存在情況并進行分型。穩定培養整合HPV-16 E6-E7D的人喉咽鱗癌FaDu細胞，利用qRT-PCR對各組標本及細胞中的miR-363、miR-15a及iR-155的表達水平進行檢測。結果 28例喉咽鱗癌標本中HPV陽性者檢出7例，其中HPV-18型1例，HPV-52型1例，HPV-16，33混合型1例，HPV-16，52混合型1例。qRT-PCR檢測結果顯示：HPV-16陽性喉咽鱗癌組織和細胞miR-363 和miR-15a表達均顯著上調，而miR-155表達水平均則沒有顯著變化。結論 HPV-16感染能夠影響人喉咽鱗癌組織及FaDu細胞miRNA表達水平。

HPV-16；喉咽鱗癌；FaFu細胞；miRNA；調控

頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，病因學調查結果提示大量吸煙、飲酒是主要誘因，但是約有超過20%的此類腫瘤患者無煙酒嗜好，推測發病原因可能與HPV-16感染相關［1］。研究發現，HPV相關的HNSCC具有獨特的臨床特征，并且生物學行為與HPV陰性的HNSCC相比也存在較大差異，產生這些差異的機制尚待探索［2］。

本研究分別檢測了僅感染高危型HPV-16喉咽鱗癌組織miRNAs表達水平；穩定感染HPV-16 E6-E7前后FaDu細胞miRNAs表達水平以及HPV陽性的喉咽鱗癌組織和細胞中miRNAs表達水平，探索HPV-16感染對喉咽鱗癌miRNAs表達的影響。

1　材料與方法

1.1標本采集：標本采集于自2013年7月至2014年6月，在鄭州大學第一附屬醫院咽喉頭頸外科接受喉咽鱗癌手術切除的患者。

1.2細胞株：成功整合入HPV-16 E6-E7基因的人喉咽鱗癌FaDu細胞株由本課題組構建。

1.3PCR-反向點雜交法檢測標本中HPV DNA并分型：參照AxyPrep公司基因組DNA小量試劑盒說明書提取人喉咽鱗癌組織新鮮冰凍組織DNA。PCR-反向點雜交法檢測手術切除的喉咽鱗癌新鮮冰凍組織標本中的HPV并進行分型。

1.4qRT-PCR檢測miR-363，miR-15a，miR-155表達：參照Small RNA提取試劑說明書提取細胞Small RNA。應用TaqMan 探針法分別擴增整合入HPV-16 E6-E7基因的FaDu細胞和HPV-16陽性的人喉咽鱗癌新鮮冰凍組織中miR-363，miR-15a，miR-155以及內參照U6。使用ABI 7500 fast PCR儀進行擴增。

1.5統計學分析：采用統計軟件包SPSS17.0分析。實驗數據用（± s）表示；多組均數間檢驗采用單因素方差分析；組織標本與細胞株miRNA相對表達量比較采用Wilcoxon Signed Ranks Test分析。

2　結 果

2.128例喉咽鱗癌標本中7例檢測出為HPV陽性：單一型別HPV感染共5例：HPV-16型3例，HPV-18型1例，HPV-52型1例；兩種型別混合感染共2例：HPV-16，33型和HPV-16，52型。

2.228例喉咽鱗癌患者臨床特征：大量吸煙的界定標準：吸煙超過20年且每天吸煙量≥1包；大量飲酒的界定標準：飲酒超過20年且每天≥150 g。臨床資料見表1。

2.3qRT-PCR檢測miR363、miR15a和miR155表達結果：HPV-16陽性喉咽鱗癌組織中miR-15a、miR-363表達均顯著上調，miR-155無明顯改變；感染HPV-16 E6-E7的FaDu細胞中miR-15a和miR-363表達均顯著上調，miR-155仍然沒有顯著變化；HPV-16陽性的喉咽鱗癌組織和細胞中發現miR-363、miR-15a和miR-155的表達均無顯著差異；HPV-16陰性的喉咽鱗癌組織與FaDu細胞中miR-363、miR-15a和miR-155表達亦無顯著性差異。見圖1。

圖1　HPV+組織/細胞與HPV-組織/細胞miR-363，miR-15a，miR-155相對表達水平比較

3　討 論

HPV相關的HNSCC呈逐年上升趨勢，但由于其預后相對較好，吸引了許多研究者來探索HPV相關的HNSCC的發病機制。micro RNA是近年來研究發現的一種內源性小分子RNA，通過介導目的mRNA降解或抑制其翻譯過程，來負調控下游靶基因的表達。研究發現miRNAs與許多疾病密切相關，尤其在腫瘤的發生過程中通常存在著micro RNA的異常表達，既可以發揮癌基因的作用，又可以扮演抑癌基因的角色，發生這些現象的作用機制仍需深入研究［3］。

有研究［4］報道稱在HPV陽性的HNSCC細胞中miRNA表達譜發生了明顯的改變，并且通過基因芯片技術和qRT-PCR檢測出在HPV-16陽性HNSCC細胞中表達上調的有miR-363、miR-33和miR-497；表達下調的有miR-155、miR-181a、miR-29a、miR-181b、miR-218，以miR-155和miR-363改變最為明顯。此外，通過將HPV陽性的HNSCC標本與HPV陽性的宮頸癌標本miRNA表達譜進行對比后發現在HPV陽性HNSCC中以miR-15a上調最為明顯。本研究結果也發現HPV-16陽性的喉咽鱗癌組織中miR-15a表達水平明顯高于HPV陰性者，并且穩定感染HPV-16 E6-E7的FaDu細胞中miR-15a表達也顯著高于未感染者。那么作為一種抑癌基因，miR-15a在HPV-16陽性喉咽鱗癌組織中表達如此之高，能否認為是HPV相關HNSCC預后較好的原因之一，為我們進行下一階段的研究提供了一個重要的線索。

［1］ Ranee Mehra, K. Kian Ang, Barbara Burtness.Management of Human Papillomavirus-Positive and Human Papillomavirus-Negative Head and Neck Cancer［J］.Semin Radiat Oncol,2012,22（2）：194-197.

［2］ 高樹峰,張少容,徐蓮,等.慢病毒介導的siRNA靶向CD47基因對人喉癌細胞Hep-2增殖、凋亡的影響［J］.解放軍醫學雜志,2013,38（8）：634-638.

［3］ 李博,馬俊,劉麗玉,等.沉寂miR-345表達對胃癌細胞增殖的影響及其機制探討［J］.中華全科醫學,2015,13（7）： 1048-1050.

［4］ Walter V,Yin X,Wilkerson MD,et al.Molecular subtypes in head and neck cancer exhibit distinct patterns of chromosomal gain and loss of canonical cancer genes［J］.PLoS One,2013,8（2）：e56823.

R739.65

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1671-8194（2016）20-0043-02

河南省科技攻關計劃項目（No.112102310679）

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