深化免疫學實驗教學改革 培養創新型人才*

◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

深化免疫學實驗教學改革 培養創新型人才*

◆姜丹 王飛 孟令軍 張洋 劉洋 劉艷 孟慶繁

免疫學實驗是生物學實驗教學的重要組成部分，是本科生獲得免疫學知識和加深對理論知識理解的重要途徑。根據免疫學實驗教學特點，通過整合實驗教學內容、統籌安排實驗時間，并以多克隆抗體制備實驗為例，改進實驗方案，使學生在實驗教學過程中多角度、多層次理解實驗原理和操作過程，在有限時間內掌握更多的實驗技術，提高實驗成功率，從而培養學生創新能力、綜合分析問題解決問題的能力，以及縝密的科學思維和團隊協作意識，提高實驗教學質量。

免疫學實驗；教學改革；實驗教學

10.3969/j.issn.1671-489X.2016.12.129

1　前言

免疫學是生命科學領域中重要的基礎課程。免疫學實驗課既是理論課程的驗證和補充，又是培養學生創新能力、獨立思考能力、分析解決問題能力的重要手段［1］。如何使本科生通過免疫學實驗課程增加對理論知識的理解，在較短時間內掌握更多、更前沿的免疫學實驗技術，是目前免疫學實驗教學的突出問題。

結合免疫學實驗課的教學特點，筆者經過幾年的探索和實踐，在實驗教學中進行了一系列改革工作，優化整合了實驗教學內容，統籌安排實驗教學時間，改進實驗設計方案，使學生得到更多的獨立動手機會，提高其獨立思考分析解決問題的能力，使免疫學實驗的教學水平和效果都得到很大程度的提高。

2　整合與優化實驗教學內容

吉林大學國家級生物基礎實驗教學示范中心（以下簡稱“中心”）始終圍繞以提高人才培養質量為核心，堅持“以學生為本，協調培養學生的知識、能力和素質”的育人理念，根據學科的發展和社會的需要，修訂實踐教學大綱和教學內容。對2009版實踐教學大綱中免疫學實驗的實驗項目進行調整，刪除和整合部分實驗內容，按照抗體的制備、淋巴細胞功能檢測技術、NK細胞功能檢測技術、抗原抗體反應、免疫標記技術、細胞因子檢測技術等6個部分重新建立實驗項目14個。適當削減了驗證性實驗，增加了綜合性實驗，在整個免疫學實驗教學體系中既有必做實驗，又有選做實驗，使學生有更多的選擇空間。

另外，為了使本科生實驗教學的內容與科研相通，引進2個準確度和靈敏度高、重現性好、操作簡便、耗材低、對環境污染少的成熟的科研實驗來充實免疫學實驗教學內容［2］；同時，為了提高本科生免疫學實驗操作動手能力、規范學生實驗操作的標準化，新增加1個免疫學實驗操作基本技術的培訓實驗項目，整合后的實驗項目共16個，更注重于學生的綜合創新能力和實驗動手操作能力的培養。

3　統籌安排實驗時間

中心的免疫學實驗教學需要完成酶標儀檢測技術、凝集實驗（示教）、單克隆抗體制備（示教）、多克隆抗體制備、淋巴細胞功能檢測實驗、NK細胞功能檢測實驗、設計實驗等多個實驗項目。筆者曾將每一個實驗項目分開進行，由于多克隆抗體制備實驗中免疫動物階段需要的時間較長，這樣完成整個免疫學實驗教學需要兩個多月的時間。在這個時間范圍內就造成前松后緊的情況，往往使學生不能很好地把握實驗內容，容易產生厭煩情緒，從而影響實驗效果［3］。

為了改善這種情況，統籌安排實驗時間，在多克隆抗體制備實驗中免疫動物的一個月時間內，穿插進行另外幾個實驗項目的內容，既保證每個實驗項目相對獨立地開展，又兼顧了長時間綜合性實驗的連續性和完整性。這樣在完成一個實驗項目的時間范圍內，完成了整個免疫學的實驗教學內容，時間從兩個多月縮短為一個多月，不僅使課程節奏相對統一，保障實驗教學效果，而且節省了學生和教師的時間，提高了實驗室的利用率。經過幾年的教學實踐，得到教師和學生的廣泛認可和好評。

4　改進實驗設計方案

在本科生免疫學實驗教學中，抗體制備是最為經典的免疫學實驗項目之一，也是生物學科學研究領域中常用的一種實驗手段。下面以多克隆抗體制備實驗為例，介紹免疫學實驗教學方案設計和改進等方面的工作進展和經驗。

多克隆抗體制備實驗的基本流程 多克隆抗體制備實驗的基本流程如圖1所示，使用具有較高免疫原性的雞卵清白蛋白（OVA）作為抗原，注射免疫小鼠。經3次免疫后的小鼠血清經過梯度稀釋后，采用間接法酶聯免疫標記技術（ELISA）檢測，據此判定所制備的多克隆抗體的效價。

*項目來源：吉林省教育教學改革重點項目“多功能酶標儀熒光偏振免疫分析功能的開發及應用”（基金編號：409020720134）。作者：姜丹，吉林大學生命科學學院工程師，研究方向為實踐教學與管理研究；王飛、孟令軍、張洋、劉洋、劉艷，吉林大學生命科學學院；孟慶繁，通訊作者，吉林大學生命科學學院副院長兼中心常務副主任，主要從事實驗室建設與管理研究（130012）。

圖1　多克隆抗體的制備流程

小鼠免疫方法的改革 在多克隆抗體制備實驗中，小鼠需要進行3次免疫注射。小鼠的注射給藥方式有腹腔注射、靜脈注射、皮下注射、皮內注射、肌肉注射等。小鼠的尾靜脈注射是科研中最常用的給藥方法，但因為操作難度較高，需要較長時間的操作訓練才能熟練掌握，因此對于初學者成功率較低，在本科生實驗中不采用此方法。

在以前的實驗教學中選用的是小鼠肌肉注射法，這種方法在操作時需要一個人固定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的后肢，右手拿注射器，將注射器與半腱肌呈90°角迅速插入1/4，注入藥液。由于這種方式需要兩個人的配合，對于從未進行過小鼠給藥注射的初學者來說困難程度較大，尤其在完成第一次小鼠免疫的時候，常常因為手法生疏、配合不善，造成被小鼠咬傷或被注射器刺傷的情況。另外，由于小鼠體積小，肌肉層淺薄，肌肉注射也會造成小鼠不適或肌肉壞死等情況。

針對這一問題，改用小鼠頸部皮下注射免疫法，這種方法是將藥液推入皮下結締組織，經毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環的過程。操作時，用左手抓住小鼠的頸部皮膚，然后將皮膚提起，注射針頭取一鈍角角度刺入皮下，把針頭輕輕向左右擺動，易擺動則表示已刺入皮下，再輕輕抽吸，如無回血，可緩慢地將藥物注入皮下；拔針時左手拇、食指捏住進針部位片刻，以防止藥物外漏。這種方法操作比較簡單，而且一個人操作即可，因此在小鼠免疫的第1次和第2次注射時均采用此方法進行，成功率較高，并且被小鼠咬傷的幾率降低。

在熟練掌握了小鼠皮下注射操作的情況下，為了使學生在小鼠免疫過程中盡可能多地掌握其他的給藥注射方式，在給小鼠第3次免疫時選用腹腔注射的給藥方式。這種方法是將藥物注入胃腸道漿膜以外、腹膜以內，由于腹膜面積大，密布血管和淋巴管，因此吸收速度較快。操作時用一只手固定小鼠，使小鼠的頭部向下，這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止刺傷腹部器官；注射器針頭以45°角插入腹中線右側，緩緩將藥液推入；注射完畢后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。這種注射方式相對簡單易行，學生在進行實驗操作過程中成功率較高，并且較為安全。

小鼠實驗組設計方案的改革 在以前的小鼠免疫過程中將小鼠分為有佐劑和無佐劑兩組，每組2只小鼠，分別注射抗原＆免疫佐劑的混合液和抗原＆生理鹽水的混合液。有佐劑組多克隆抗體制備效果較好，最終得到的多克隆抗體效價較高；而無佐劑組多克隆抗體制備效果較差，最終得到的多克隆抗體效價較低。

通過上述實驗分組，可以讓學生較好地認識到免疫佐劑在抗體制備中的作用。然而通過多年的教學實踐，發現上述實驗分組方案存在兩方面弊端。

1）實驗動物浪費現象嚴重。一只小鼠通過摘眼球取血的方式，能夠獲得不少于100 μL的血清，而抗體效價檢測所需的血清用量是5 μL，因此，每個實驗組設置2只小鼠的作用僅僅是為了防止學生在免疫過程中由于操作不當或飼養不經心而發生的小鼠死亡。通過連續數年的教學實踐觀察，筆者發現在小鼠免疫過程中發生死亡的概率只有1%，即每學年50組學生總計200只小鼠的意外死亡數量平均只有2只，而為此額外設置2倍的小鼠用量是對實驗動物的嚴重浪費。

2）無佐劑組小概率出現高效價抗體。雖然無佐劑組制備的多克隆抗體一般情況下效價都不高，可以作為免疫佐劑功能的陰性對照，但OVA較高的免疫原性使得無佐劑組小鼠中個別個體依然會產生較高的抗體效價，對ELISA實驗的抗體效價數據假陽性產生質疑，使學生對理論知識的理解造成一定的混淆。

針對上述實驗方案的缺陷，對原有的小鼠實驗組設置方式進行優化，如表1所示。將實驗小鼠分為有佐劑組、無佐劑組和無抗原組，每組1只小鼠。有佐劑組注射免疫佐劑和抗原的混合液，無佐劑組注射抗原的生理鹽水溶液，無抗原組只注射等量的生理鹽水。同時在實驗課進行過程中，由助教按照標準流程與學生平行進行一組示范實驗，所得的小鼠血清作為標準樣本備用。新的小鼠實驗組設置有效地解決了實驗小鼠的浪費現象和陰性對照組不全的問題，在發生小鼠意外死亡的小概率事件時，任課教師會在ELISA實驗時為該組提供相應的標準血清使其順利完成ELISA實驗。另外，無抗原組作為抗原的陰性對照組是不會出現任何抗體效價信號的，在無佐劑組出現小概率高效價信號時能夠起到很好的對照和參考作用。

表1　免疫小鼠實驗組

5　結語

針對免疫學實驗教學中存在的問題，對實驗教學內容的設置、實驗教學時間的統籌安排、實驗設計方案的改進進行一系列的改革和探索，使免疫學實驗教學質量有了大幅度的提高。同時，學生的實驗興趣與科研能力顯著提升，由被動學習轉變為自主性學習、合作性學習和研究性學習。在此基礎上要不斷完善，使實驗教學水平更上一個新的臺階，為發展學生創新思維能力，進一步獲取和創造新知識打下基礎［4-5］?！?/p>

［1］王敏，包常華.提高醫學免疫學實驗教學質量的探索與體會［J］.基礎醫學教育，2014，16（11）：938-939.

［2］蘇小平，王全興.本科生免疫學實驗教學改革實踐［J］.基礎醫學教育，2014，16（8）：612-622.

［3］任可，陳建芳，常江，等.醫學免疫學實驗教學改革初探［J］.中國免疫學雜志，2014（30）：1259-1260.

［4］潘清.創新實驗教學探索［J］.實驗技術與管理，2010，27（8）：24-26.

［5］由繼紅.實驗室與創新教育研究［J］.實驗技術與管理，2010，27（9）：16-17.

G642.0

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1671-489X（2016）12-0129-03