除草劑對斑馬魚毒性效應研究概述

袁桂平，陳靖宇，金晨鐘，歐曉明*,2，譚顯勝

(1.湖南人文科技學院 農田雜草防控技術與應用協同創新中心/農藥無害化應用重點實驗室，湖南婁底 417000；2.湖南化工研究院國家農藥創制工程技術研究中心，湖南長沙410014)

除草劑對斑馬魚毒性效應研究概述

袁桂平1，陳靖宇1，金晨鐘1，歐曉明*1,2，譚顯勝1

(1.湖南人文科技學院 農田雜草防控技術與應用協同創新中心/農藥無害化應用重點實驗室，湖南婁底 417000；2.湖南化工研究院國家農藥創制工程技術研究中心，湖南長沙410014)

除草劑的大量、不合理使用對水體造成了嚴重污染，威脅水生生物的生存及人類健康。不少研究者開始對除草劑生態環境風險評估進行研究。斑馬魚因其自身獨特的優勢而已成為國際公認的模式脊椎動物之一，是污染物風險評估選用的絕佳材料之一。對斑馬魚在風險評估中的地位、除草劑對斑馬魚及其胚胎的毒性與富集進行了綜述。

除草劑；斑馬魚；毒性

雜草不僅與作物競爭養分、陽光、水分，而且還是一些病蟲的寄主，使作物的產量大幅下降，使糧食、水果、蔬菜等品質降低。雜草對作物造成的危害不容忽視。根據美國農業部、FAO發布的數據，2014年全球水稻、小麥、玉米總產量在理想狀態下分別為70 703萬t、72 500萬t、102 200萬t，按全世界每年因雜草造成農作物減產9.7%計算，水稻、小麥和玉米損失量約為6 858萬t、7 033萬t和9 913萬t。為了更有效地防除雜草，除草方式由費力、費時、低效率、防除效果差的人工除草發展到現在的省力、省時、高效率、防除效果好的化學除草。除草劑的使用給人們提供了便利，并帶來巨大的經濟效益，但不合理使用造成水體污染，進而威脅水生生物的生存及人類健康。近年來越來越多的研究者開始研究除草劑對水生生物的影響。

斑馬魚因其自身優勢被廣泛用于農藥生態風險評估、環境毒理研究、生命科學研究、人類疾病研究、藥物篩選、食品安全檢測等領域，是廣泛應用的重要指示生物。國內外不少研究者以斑馬魚為試驗材料，研究了除草劑對它的毒性效應，從而評估除草劑對水生動物的危害以及對人類健康的影響。據此，本文擬對除草劑對斑馬魚的毒性效應、斑馬魚對除草劑的富集作用等方面進行綜述，以飧讀者。

1 斑馬魚在風險評估中的地位

最早的“生態風險評價基準”是由美國EPA制定，魚類和無脊椎動物中的浮游動物是主要生態受體[1]。魚類在水生生態系統中所處的營養級別高，對水體污染物敏感，且又是脊椎動物的代表性動物，適用于對水體污染物進行生態風險評估。斑馬魚體型小，3～4 mm的幼魚就可以用來做試驗，是目前唯一可進行微孔板高通量試驗的脊椎類動物。相對于OECD及相關組織推薦使用的國際魚種虹鱒魚、鯉魚、草魚等，成年斑馬魚體型小很多，體長5 cm左右，體重0.5 g左右。按照化學農藥環境安全評價試驗準則，試驗溶液容納量小于1 g/L，供試魚質量小就會減少供試藥品的用量，這對于樣品少且難以獲得的供試物，選用斑馬魚作試驗材料不僅很有必要，而且具有明顯優勢。一是斑馬魚繁殖能力很強，雌魚每次產卵300余枚，最多可超過1 000枚，5個月左右的成魚就可以繁殖下一代，繁殖不受季節的影響。相比于青鳉魚，斑馬魚的繁殖能力是它的數十倍。二是斑馬魚受精率高達70%～80%，容易獲取試驗所需要的大量樣本。三是斑馬魚世代周期短，斑馬魚體外受精，胚胎孵化，發育快。魚卵孵化一般只需4 d，受精后24 h，各種器官就基本形成，是用來研究污染物對水生動物多代影響的好材料。此外，斑馬魚胚胎還是污染物風險評價的絕佳試驗材料。斑馬魚胚胎透明，借助顯微鏡就可以看到發育全過程，并且從受精胚胎開始發育到孵化結束，可以觀察到約20種不同表現的反應指標[2]，例如卵凝結狀況、胚囊發育狀況、畸形狀況等。斑馬魚胚胎不同時期的形態特點和發育全過程已被研究者熟知[3]，有助于開展風險評估研究。

2 除草劑對斑馬魚的毒性

水生生物慢性毒性試驗既可確定干擾水生生物的正常生長、發育和繁殖能的化學污染物濃度，確定污染物對水生生物的最大無作用劑量，還可闡明污染物對水生生物產生慢性毒性作用的性質、靶器官和中毒機制。研究除草劑對斑馬魚的慢性毒性，不僅豐富了除草劑對魚類的毒性資料，還為制定相關水質標準提供依據，因此受到重視。國外用斑馬魚作為試驗材料進行急性毒性研究開始于20世紀70年代末[4]，到了90年代初期，斑馬魚開始被用于急、慢性聯合毒性試驗[5]，現在斑馬魚是國際標準化組織推薦使用的毒性試驗材料[6]。

通常進行急性毒性試驗以評價農藥對非靶標生物毒性。農藥登記時需提供該農藥對環境的風險評估資料，其中急性毒性數據是開展風險評估的基石。胡競進等[7]采用靜態法研究了乙草胺對斑馬魚成魚和胚胎的急性毒性和對胚胎的致畸作用，發現乙草胺對斑馬魚成魚LC50(96 h)為3.04 mg/L，屬中等毒性，對胚胎的LC50(120 h)為5.32 mg/L；斑馬魚受精后胚胎于0.3 mg/L乙草胺中暴露5 d，幼魚可出現心包囊水腫、脊索彎曲等致畸現象。Cao等[8]研究發現氰氟草酯對斑馬魚成魚、孵化后12 h的幼魚、孵化后3 d的幼魚LC50(96 h)分別為3.49、0.58、1.42 mg/L，這說明該除草劑對斑馬魚具有中等毒性，同時發現當斑馬魚胚胎和幼魚暴露在1.00 mg/L或更高濃度的氰氟草酯藥液中，胚胎孵化率降低，斑馬魚幼魚自主活動和體長的增長受到抑制。趙倩等[9]以除草劑撲草凈作為目標污染物，模式生物斑馬魚作為受試生物，研究了撲草凈對斑馬魚的96 h急性毒性以及在腐殖酸(HA)存在下撲草凈對斑馬魚的毒性變化情況，結果顯示撲草凈對斑馬魚的96 h半致死濃度(LC50)為7.448 mg/L，同時發現5 mg/L的HA對撲草凈的毒性沒有顯著影響，但當撲草凈濃度為8.5 mg/L時，15 mg/L的HA增加了撲草凈對斑馬魚的96 h累積死亡率，較相同撲草凈濃度無HA組高40%，這可能是由于較高濃度(大于LC50)的撲草凈與HA共存時，減少污染物毒性的絡合機制被其他能夠引起毒性增加的機制所掩蓋。懸浮沉積物可以通過吸附作用降低有機污染物在魚體內的表觀生物富集作用，但是仍不清楚該過程是否也可以減少有機污染物對魚等非靶標水生生物的毒性。Yan等[10]研究了在天然沉積物存在時莠去津對魚的毒性，發現在無懸浮沉積物存在下莠去津對斑馬魚的LC50(96 h)為29.06 mg/L，但當在水中添加濃度為7 500、15 000 mg/L懸浮沉積物后，莠去津對魚的LC50(96 h)分別為 30.74、39.51 mg/L，其無明顯效應濃度(NOEC)分別為3、9、15 mg/L。這說明懸浮沉積物可以降低斑馬魚對莠去津的吸收速率，進而降低藥劑對魚的急性毒性。Wirbisky等[11]研究發現經30 μg/L莠去津藥液處理的斑馬魚胚胎孵化出的斑馬魚，其產卵量較對照組明顯減少，后代頭長與體長比值明顯減小，頭寬與體長比值明顯增大，說明該除草劑對斑馬魚的生長發育和生殖有影響。Al-Sawafi等[12]研究了莠去津對斑馬魚的慢性毒性，試驗結果表明斑馬魚體內的AChE的活性顯著下降，

CAT和SOD活性明顯升高(CAT對莠去津的敏感性更高)，說明了該除草劑對斑馬魚具有一定的慢性毒性。Plhalova等[15]將30日齡斑馬魚暴露在0.3、3.0、30.0、90.0 μg/L等不同濃度的莠去津藥液中28 d，結果發現當暴露濃度為0.3 μg/L時，斑馬魚的生長和組織發育沒有受到任何影響；莠去津對斑馬魚的最大無效應濃度為30 μg/L；對斑馬魚的最低可見效應濃度為90.0 μg/L，在此濃度，斑馬魚生長發育變得遲緩。這對莠去津的科學使用有重要指導意義。

3 除草劑對斑馬魚胚胎發育的影響

很多學者認為在生命的整個過程中，對外源化學物質最敏感的時期是胚胎期[14]。在1998年，斑馬魚胚胎發育法就被OECD列為測定單一化學品毒性的標準方法之一[14]。很多研究者利用斑馬魚胚胎進行急性毒理表型分析，涉及到的化學物質越來越多，包括除草劑、芳香族化合物和殺蟲劑等[15]。除草劑的化學結構決定了除草劑的生理活性和毒性，不同除草劑對斑馬魚胚胎發育的影響不同，不同濃度的同種除草劑對斑馬魚胚胎發育的影響也不同，胚胎暴露在同種除草劑同種濃度中，受到的影響會因暴露的時間長短而不同。

胡競進等[7]根據窗口期暴露試驗發現斑馬魚受精3 h后胚胎于0.06 mg/L乙草胺中暴露10、14 d，以及在0.3 mg/L乙草胺中暴露10 d，幼魚脫碘酶基因(d1、d2)、甲狀腺激素受體基因(trα、trβ)、鈉/碘同向轉運體基因(s1c5a5)、促甲狀腺激素釋放激素基因(crh)、促甲狀腺激素基因(tsh)等的表達呈現不同程度下調，而在0.3 mg/L乙草胺中暴露14 d，除d1的表達量顯著上調外，其余各相關基因的表達均無明顯變化，這說明乙草胺能夠干擾斑馬魚幼魚早期發育，且在不同暴露濃度和時間下干擾效應存在較大差異。劉迎等[16]采用斑馬魚胚胎發育技術研究了5種酰胺類除草劑對斑馬魚胚胎的致死效應和致畸效應，結果發現隨著染毒劑量的增加，斑馬魚胚胎孵化率逐漸降低，甲草胺、乙草胺、丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺等5種酰胺類除草劑顯示出相似的趨勢，處理質量濃度與胚胎孵化率之間存在劑量-效應關系，均誘導斑馬魚胚胎出現心包囊水腫、游囊關閉、軀干彎曲等癥狀，對斑馬魚胚胎的致畸指數分別為1.53、1.59、1.89、2.50、2.44，均具有致畸效應。Xu等[17]研究證實，當斑馬魚胚胎暴露在2、8、15、30、60 μM等系列濃度的乙草胺及其對映異構體試驗液中，斑馬魚胚胎死亡率與暴露時間和暴露濃度呈正相關關系，LC50(72 h)為48.4～53.1 μM，在暴露期間斑馬魚胚胎還表現出一定的畸形現象如卵黃囊水腫，EC50(48 h)為36.7～54.1 μM。Roy等[18]研究發現將處于原腸胚期的斑馬魚胚胎暴露在50 μg/mL的草甘膦溶液中，發現50 μg/mL草甘膦會引起斑馬魚心房和心室結構異常。Zhu等[19]將斑馬魚胚胎暴露在不同濃度的氰氟草酯溶液中，受精后120 h內不同時間段胚胎的死亡數證明了氰氟草酯對斑馬魚胚胎具有高度毒性。張洪等[20，21]為了獲知水環境中亞致死劑量的氯吡嘧磺隆對斑馬魚肝臟的影響，將斑馬魚暴露在亞致死劑量的氯吡嘧磺隆藥液中8 d，采用超高效液相色譜與四級桿-軌道離子阱質譜串聯對斑馬魚的肝臟代謝物進行分析，采用SIEVE軟件將圖譜信息轉換為含有保留時間、質荷比和相對峰面積的二維數據陣，結合mz Cloud，Human Metabolome Database(HMDB)數據庫共鑒定出氨基酸、糖、有機酸等33種代謝物。采用SIMCA軟件對正離子和負離子模式下的檢測結果進行主成分、偏最小二乘法和正交校正的偏最小二乘法，結果發現對照組與處理組的代謝物在2種檢測模式下均存在顯著差異，認為肌酸酐、牛磺酸、多巴胺和5b-膽甾醇硫酸酯對分組貢獻最大(P＜0.01)，可作為斑馬魚在氯吡嘧磺隆亞致死劑量脅迫下肝臟代謝異常的潛在標記物。

4 除草劑在斑馬魚體內的富集作用

生物富集研究對闡明農藥在環境中的行為，評價和預測水環境中農藥的慢性危害以及制定環境質量標準有十分重要的意義。但是除草劑在魚體內的富集作用因除草劑種類及其暴露時間而異，即使是同一除草劑在魚體內不同組織的富集程度也存在差異。Al-Sawafi等[12]將斑馬魚分別暴露在0.957、1.913 mg/L的莠去津藥液中24 h，其最高富集系數分別為128 543和135 891；斑馬魚暴露在0.638 mg/L的莠去津藥液中25 d，其最高富集系數為132 380，說明斑馬魚能迅速富集該除草劑。由此推測人體如長期接觸該除草劑，健康將受到影響。張洪等[21]在水中加入氯吡嘧磺隆原藥，分時間段采集樣品，采用LC-MS測定水中和動物組織中的氯吡嘧磺隆以監測該藥在斑馬魚組織器官中的分布，結果發現斑馬魚暴露在1 mg/L的氯吡嘧磺隆試驗液中8 d后斑馬魚鰓、肌肉和肝臟中均含有氯吡嘧磺隆。氯吡嘧磺隆在斑馬魚組織中的含量大小依次為肝臟＞鰓＞肌肉。何健等[22]參照2甲4氯和2甲4氯異辛酯96 h的LC50合理設置暴露濃度進行富集試驗，結果發現當斑馬魚暴露在0.5、5.0 mg/L的2甲4氯藥液8 d后，BCF8d分別是1.82和1.61，而當斑馬魚暴露在10、50 μg/L的2甲4氯異辛酯藥液8 d后，BCF8d分別是22.3、16.3，這說明除草劑2甲4氯和2甲4氯異辛酯在斑馬魚體內的富集分別屬于低等到中等程度。鄒積鑫等[23]把斑馬魚暴露在低濃度的乙羧氟草醚藥液中8 d，發現當暴露濃度為0.03、0.30 mg/L時，第8 d的生物富集系數分別是1.16和2.43，說明斑馬魚對乙羧氟草醚的富集等級為低級。

5 結束語

隨著化學除草劑使用量的增加，除草劑潛在的危害可能提早暴發，從而對水生生物造成意想不到的危害。為了降低除草劑對水生生物產生的危害以及對人類健康造成的潛在危害，建議加強除草劑對水生生物的毒性效應等方面的研究，以期為除草劑登記管理和合理使用提供科學數據。

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A review on Toxicological Effect of Herbicides to Zebrafish

YUAN Gui-ping1, CHEN Jing-yu1, JIN Chen-zhong1, OU Xiao-ming1,2, TAN Xian-sheng1
(1.Collaborative Innovation Center for Farmland Weeds Control Technology and Application, Hunan University of
Humanities, Science and Technology, Hunan, Loudi 417000, China; 2.National Engineering Center for
Agrochemicals, Hunan Research Institute of Chemical Industry, Changsha 410014, China)

Frequent and unreasonable use of herbicides may cause serious pollution of water bodies, thereby threatening the survival of aquatic life and human health, so more and more researchers began to carry out risk evaluation for the ecological environment of herbicides. Zebrafish is one of the internationally recognized model vertebrates with the unique advantages and is one of the best materials for risk assessment of contaminants. The role of zebrafish in the risk assessment, acute and chronic toxicity of herbicides to zebrafish and its embryos and bioaccumulation were reviewed in this paper.

herbicide; zebrafish; toxicity

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.06.07

TQ450

：A

1009-6485(2016)06-0033-04

湖南省高校創新平臺開放基金項目(15K066)、湖南省產業化培育項目(13CY030)

袁桂平(1992—)男，湖南衡陽人，在讀碩士生，研究方向：農藥生態毒理學。

*歐曉明，E-mail： xmouhn@163.com。

2016-11-04。