懸浮組織塊法分離培養兔成纖維樣滑膜細胞

劉　琴　王麗平　陳　芳　陳利鋒　張　宜

(解放軍廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科，武漢430070)

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懸浮組織塊法分離培養兔成纖維樣滑膜細胞

劉琴王麗平陳芳陳利鋒①張宜

(解放軍廣州軍區武漢總醫院醫學實驗科，武漢430070)

[摘要]目的：建立兔成纖維樣滑膜細胞懸浮組織塊分離培養法。方法：取正常兔膝關節滑膜組織，用懸浮組織塊法分離培養兔成纖維樣滑膜細胞，觀察細胞生長狀況及形態特征，取第3代對數期細胞，CCK-8法繪制其生長曲線，免疫熒光法檢測波形蛋白的表達情況，并與組織塊貼壁法進行比較。結果：兩種方法體外培養得到的兔成纖維樣滑膜細胞形態為長梭形纖維樣，細胞生長力較旺盛，生長曲線為典型的“S”形，免疫熒光檢測顯示第3代細胞強表達波形蛋白。結論：懸浮組織塊法可以分離培養出兔成纖樣維滑膜細胞，方法簡便，效率高，為體外分離培養兔成纖維樣滑膜細胞提供了一種新的方法。

[關鍵詞]懸浮組織塊法；兔成纖維樣滑膜細胞；分離；培養

類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎為主要特征的系統性自身免疫性疾病，嚴重危害著人類健康。滑膜過度增生、增厚是造成關節損傷的主要病理基礎之一。成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLSs)為滑膜中最主要的細胞，它參與滑膜增生和組織蛋白酶的分泌，與RA晚期關節損傷有著密切的關系[1,2]。因此，FLS的體外培養是探尋RA發病機制與體外篩選藥物的重要手段。成纖維樣滑膜細胞分離培養主要方法之一為組織塊貼壁法，但存在一定的缺點，如組織塊不易貼壁、操作時間長、細胞活性較差等[3,4]。本文采用懸浮組織塊法分離培養兔成纖維樣滑膜細胞，并與組織塊貼壁法作比較。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物健康新西蘭大白兔4只，雄性，體質量1.0 kg，由武漢市新洲區萬千佳禾實驗動物養殖場提供，生產許可證號：SCXK(鄂)2011-0011，實驗單位使用許可證編號：SCXK(鄂)2014-0082。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.1.2主要實驗材料及儀器DMEM高糖培養基、PBS(Hyclone)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青鏈霉素雙抗、胰酶、CCK-8(碧云天)；小鼠波形蛋白(Vimentin)抗體、熒光(Cy3標記羊抗小鼠IgG)(武漢博士德生物工程有限公司)；倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯)；CO2細胞培養箱(日本SANYO儀器MCO-175)；生物安全柜(海爾)。

1.2方法

1.2.1組織塊懸浮法新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關節，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續向下分離，找出關節囊，用手術剪分離關節囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS中。移入超凈臺中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿3～4塊滑膜組織塊，加入2～3 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養液使其處于懸浮狀態，放入37℃、5%CO2培養箱內培養。倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態并照相。4～5 d后進行首次換液，12～14 d后細胞達到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進行1∶2傳代。

1.2.2組織塊貼壁法新西蘭大白兔2只，耳緣靜脈注射空氣處死。75%酒精浸濕膝關節，去皮，1%碘伏與75%酒精依次消毒，分離肌肉，露出膝蓋骨，繼續向下分離，找出關節囊，用手術剪分離關節囊的滑膜層和纖維層，取出平滑光亮的滑膜層組織，將滑膜組織放入含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS中。移入超凈臺中，用含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的PBS洗3次，用滅菌的濾紙吸干殘留在組織表面的水分，剪成1～5 mm3大小，置入3.5 cm平皿中，每皿7～8塊滑膜組織塊，平皿于溫箱內倒置0.5～1 h后輕輕地加入3～4 ml含100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM-H培養液，放入37℃、5%CO2培養箱內培養。3～4 d后進行首次換液。倒置顯微鏡下觀察細胞的生長形態并照相。12～14 d后細胞達到90%融合，用含0.25%EDTA的胰酶進行1∶2 傳代。

1.2.3細胞鑒定取第3代細胞，按1×105/孔接種入含有爬片的6孔板中，細胞培養48 h后，吸出培養液，用PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定液于4℃固定30 min。PBS洗3次，0.5%Triton X-100室溫通透20 min。PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30 min。吸水紙吸掉封閉液，不洗，滴加足夠量的Vimentin一抗(1∶100稀釋)并放入濕盒，4℃孵育過夜。PBS洗3次，吸水紙吸干爬片上多余液體，滴加稀釋好的熒光(Cy3)標記羊抗小鼠IgG(1∶100稀釋)，濕盒中20～37℃孵育1 h，PBS洗3次。滴加DAPI避光孵育5 min，進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.4細胞生長曲線的測定取第3代細胞，按1×103/孔接種到96孔培養板內，每組設置5個復孔，放在37℃、5%CO2培養箱內培養，分別于培養1、2、3、4、5、6、7 d后隨機取出一組，用CCK-8法檢測細胞OD值，繪制細胞生長曲線。

2結果

2.1細胞形態觀察組織塊懸浮法和貼壁法接種3～4 d后，在光鏡下可見少量細胞生長，形態多為長梭形，少數為圓形、多角形。6～7 d后，在光鏡下可見大量細胞生長，形態仍以長梭形為主，少見多角形、圓形。8～9 d去除組織塊。13～15 d，細胞數量增多，達到90%融合，形態為以典型的長梭形為主。初步判斷為兔成纖維樣滑膜細胞。培養出來的細胞6～7 d可傳代一次，傳代后大部分細胞4～7 h貼壁，12～24 h開始生長。傳至P3時，可見大量成纖維細胞樣細胞均勻分布。傳至5～6代時，細胞活性明顯下降。兩種方法所得到的細胞生長過程和細胞形態如圖1。

2.2細胞生長曲線用CCK-8法檢測兩種方法分離培養得到的第3代兔成纖維樣滑膜細胞增殖能力。結果顯示：培養出來的細胞增殖能力均較強，經過2 d潛伏期后在第4天進入對數生長期，隨著培養時間的增加而增殖，第7天進入平臺期，繪制出來的細胞生長曲線呈現典型的“S”形，見圖2。

圖1　原代兔成纖維樣滑膜細胞培養 (×100)Fig.1　Primary culture of rabbit fibroblast-like synovio-cytes(×100)Note: Suspended explant culture method A-D:A.Primary culture for 3-4 days;B.Primary culture for 6-7 days;C.Primary culture for 13-15 days;D.The third passage cells.Explants adherent culture method E-H: E.Primary culture for 3-4 days;F.Primary culture for 6-7 days;G.Primary culture for 13-15 days;H.The third passage cells.

圖2　兔成纖維樣滑膜細胞生長曲線Fig.2　Growth curve of rabbit fibroblast-like synoviocytes

圖3　免疫熒光檢測兔成纖維樣滑膜細胞胞漿中波形蛋白表達情況Fig.3　Expression of vimentin in rabbit fibroblast-like synoviocytes by immunofluorescence staining

2.3免疫熒光觀察免疫熒光檢測結果顯示，兩種方法分離得到的細胞中胚層組織特征性波形蛋白表達強陽性(圖3)。

3討論

目前，成纖維樣滑膜細胞原代培養主要方法之一為組織塊貼壁法，在操作上存在一定的缺陷。此法的重點是確保滑膜組織塊能夠牢固貼壁，但在實際操作中很難保證每塊組織塊都貼壁，尤其是在換液過程中，組織塊很容易脫落，造成滑膜組織的浪費[5]。為使滑膜組織塊貼壁更加牢固，常需要在加入培養液前將種植有滑膜組織塊的培養瓶/皿在溫箱內倒置培養1～3 h，有的甚至過夜，耗時較長[6-8]。另一方面，需要人為地將組織塊均勻種植在培養瓶瓶/皿中，增加操作時間[9]。

本實驗采用懸浮組織塊法分離培養兔成纖維樣滑膜細胞，并與組織塊貼壁法進行比較。從新西蘭大白兔膝關節中分離得到滑膜組織，剪成1～5 mm3大小，加入DMEM-H+體積分數10%胎牛血清，使組織塊處于懸浮狀態或貼壁狀態，37℃，5%CO2條件下培養，3～4 d后，在光鏡下可見細胞生長，形態多為典型的長梭形，偶見多角形和圓形。13～15 d即可達到90%融合，細胞形態以典型的長梭形為主。傳代后，可見大量成纖維細胞樣細胞均勻分布。CCK-8法檢測顯示兩種方法培養出來的第3代兔成纖維樣滑膜細胞呈現典型的“S”形，與文獻報道一致[10]。傳至5～6代時，細胞趨于老化，7～8代之后幾乎完全喪失增殖活性，建議采用3～4代細胞進行相關實驗。兩種方法所得到的兔成纖維樣滑膜細胞生長過程和細胞形態學很相似，并無明顯區別。

對于成纖維樣滑膜細胞的特異分子標志目前尚無統一的定論，但有些學者認為成纖維樣滑膜細胞表面存在尿二苷磷酸葡萄糖脫氫酶(Uridine diphosphoglucose dehydrogenase,UDPGD)、Cadherin -11(Cadherin-11)、CD14、CD44、促衰變因子(Decay accelerating factor,DAF/CD55/mAb67)、Thy-1/CD90、血管細胞黏附因子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1/CD106)、波形蛋白等[11-13]。實驗選用最常用的成纖維樣滑膜細胞鑒定蛋白Vimentin。免疫熒光檢測結果顯示兩種方法得到的P3兔成纖維滑膜細胞表達Vimentin，與袁琴等[14]人報道的相符。滑膜細胞包括巨噬樣滑膜細胞、成纖維樣滑膜細胞、樹突狀細胞，其中主要為成纖維樣滑膜細胞[15]。原代培養細胞多利用自然純化法獲得較高純度的細胞，即利用成纖維樣滑膜細胞可以貼壁生長、貼壁能力較強、增殖速度較快的特性，通過優勢生長、多次消化傳代來去除非成纖維型細胞和不健康的成纖維樣細胞，從而獲得較高純度的成纖維樣滑膜細胞。免疫熒光檢測結果發現Vimentin表達強陽性，與其他研究者分離培養得到的成纖維樣滑膜細胞Vimentin表達強陽性相符[16，17]，說明通過多次傳代可以得到高純度的兔成纖維樣滑膜細胞。

該實驗采用懸浮組織塊法成功分離培養出兔成纖維樣滑膜細胞，與傳統的組織塊貼壁法相比，懸浮中組織塊法具有一定的優勢：①操作非常簡單，處理時間短，污染機會較少，可在一定程度上克服原代培養較常出現的細菌或真菌污染問題；②此法的核心是將組織塊懸浮起來，可以解決組織塊貼壁法中組織塊貼壁不牢固的問題；③提高珍貴的滑膜組織的利用率。但是在采用懸浮組織塊法分離培養兔成纖維滑膜細胞的過程中也有一些注意事項：①取材必須保證無菌操作，取材后立即進行培養；②滑膜組織塊的接種量是采用懸浮法成功培養出兔成纖維滑膜細胞的關鍵，如一個3.5 cm培養皿加入3～4塊剪碎的組織塊即可；③為區別于組織塊貼壁法，一定要在培養皿中加入足夠量的培養液使滑膜組織塊處于懸浮狀態中。

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[收稿2015-12-03修回2016-01-11]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.017

作者簡介：劉琴(1986年-)，女，碩士，技師，主要從事細胞生物學和分子生物學方面的研究，E-mail:liuqin_0629@163.com。 通訊作者及指導教師：張宜(1965年-)，男，碩士，主任藥師，主要從事藥學信息方面研究，E-mail:abcd1566@sina.com。

中圖分類號R392.33

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-1009-04

Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes using suspended explant culture method

LIU Qin,WANG Li-Ping,CHEN Fang,CHEN Li-Feng,ZHANG Yi.

Department of Medical Experiments,Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command,Wuhan 430070,China

[Abstract]Objective:To isolate rabbit fibroblast-like synoviocytes(FLSs) by suspended explant culture method.Methods: The healthy rabbit joint synovial layers were obtained.The cells were cultured by suspended explant culture method and compared with the explants adherent culture method.The growth status and morphology were observed.The growth curve of the 3rd passage cells was measured by CCK-8 assay,and the expression of vimentin was tested by immunocytochemistry.Results: The FLS obtained by the two methods exhibited a spindle-shaped appearance and could rapidly expand.The cell growth curve was typical of S type,and the cells highly expressed vimentin.Conclusion: Primary culture of rabbit fibroblast-like synoviocytes by suspended explant culture method were successfully established.The method was simple and highly efficient.It provided a new method for the isolation of FLS in vitro.

[Key words]Suspended explant culture method;Rabbit fibroblast-like synoviocytes;Isolation;Culture

①解放軍廣州軍區武漢總醫院中西醫結合科，武漢430070。