不同時間慢性間歇性缺氧對大鼠海馬細(xì)胞凋亡及Caspase- 3表達(dá)的影響

西電集團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安710077)　張　恒　姚　力　侯沛紅　何劍波　李會琪

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不同時間慢性間歇性缺氧對大鼠海馬細(xì)胞凋亡及Caspase- 3表達(dá)的影響

西電集團(tuán)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(西安710077)張恒姚力△侯沛紅何劍波李會琪

摘要目的：研究在不同持續(xù)時間下慢性間斷性缺氧(CIH)對大鼠海馬區(qū)中神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響。方法：取健康雄性SD大鼠30只隨機(jī)分為三組，即對照組(10只)、CIH4周組(10只)和CIH8周組(10只)。分別用原位未端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠腦組織中的凋亡細(xì)胞和Caspase-3蛋白表達(dá)。結(jié)果：CIH8周組同其他兩組相比，具有顯著差異(P<0.01)；組間多重比較也存在著顯著差異(P<0.05)。CIH4周組及CIH8周組海馬區(qū)均可見Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，CIH8周組Caspase-3陽性表達(dá)與CIH4周組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:伴隨著CIH持續(xù)時間的不斷增加，神經(jīng)細(xì)胞凋亡的數(shù)量也不斷增加，Caspase-3蛋白表達(dá)也增強(qiáng)(P<0.01)。CIH持續(xù)時間對大鼠腦組織細(xì)胞凋亡有著重要意義。

主題詞缺氧 細(xì)胞凋亡@Caspase- 3

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(簡稱OSAS)主要表現(xiàn)為不斷重復(fù)出現(xiàn)的低氧、高碳酸血癥以及睡眠混亂，并最終導(dǎo)致器官出現(xiàn)損傷[1-2]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶的級聯(lián)通路的效應(yīng)分子，主要功能就是控制細(xì)胞凋亡的發(fā)生與否。有文獻(xiàn)報道慢性間歇性缺氧(CIH)不同嚴(yán)重程度對大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡有著差異性表達(dá)[3]，但對CIH不同持續(xù)時間報道卻鳳毛麟角。本文根據(jù)OSAS患者發(fā)生CIH時的主要特征來建立大鼠模型 ,采取不同時間長度干預(yù)，觀察 CIH 對大鼠前額葉區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡及Caspase- 3表達(dá)的影響。

材料與方法

1材料30只雄性200～250gSD大鼠，設(shè)對照組、CIH4周組、CIH8周組(n=10),Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、MaxVisionTM一步法試劑盒、原位細(xì)胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒。

2方法本文所選用的模型參照了文獻(xiàn)[4]的方法，制作出相應(yīng)的氧濃度變化趨勢圖，如圖1。實驗結(jié)束后進(jìn)行TUNEL染色及免疫組織進(jìn)行化學(xué)染色。在光鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件來測量相應(yīng)的累積吸光度值(簡稱為IOD) 表示Caspase- 3表達(dá)水平。

圖1　間歇性缺氧箱內(nèi)氧濃度變化趨勢圖(1個周期)

結(jié)果

在400倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)凋亡的細(xì)胞呈藍(lán)黑色，結(jié)果可以參照凋亡小體。對照組則無TUNEL陽性細(xì)胞；與其余兩組比較，CIH8周組凋亡細(xì)胞明顯增多(F=29.32，P<0.01)；實驗組海馬區(qū)均可見Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。各組間多重比較有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠腦組織TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較及Caspase-3免疫組化結(jié)果比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與CIH4周組比較，△P<0.05

討論

OSAS的后果已被廣泛研究從實驗和臨床水平證實，主要病理就是CIH，是腦血管疾病的獨(dú)立危險因素。全身和器官特異性氧化應(yīng)激通過間歇性缺氧觸發(fā)被認(rèn)為OSAS這些中期和長期后果的關(guān)鍵作用[5-6]。細(xì)胞凋亡尤其在神系統(tǒng)變性病的發(fā)病機(jī)制中起到至關(guān)重要的作用，針對CIH以后的大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象以及相應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行研究，能夠很好地揭示這些疾病之間的關(guān)系。本研究通過控制密閉箱內(nèi)不同氣體持續(xù)時間，設(shè)置了靜息狀態(tài)，并通過快速氧氣輸入，使箱內(nèi)氧濃度快速提升到大氣中氧濃度水平。這種以濃度結(jié)合時間切換方式，更加地接近OSAS的臨床真實狀態(tài)。經(jīng)缺氧處理后，經(jīng)過測量氧濃度和大鼠動脈血?dú)獾姆治鲆院螅梢缘贸鼋Y(jié)論：這種處理方法能夠很好地模擬出OSAS的血氧變化情況。

所謂的細(xì)胞凋亡，其實就是受到細(xì)胞內(nèi)的基因和酶控制的一個過程，涉及到很多個通路，而對這些通路起關(guān)鍵作用的就是Caspase 家族。其中Caspase-3 是最重要的一個起執(zhí)行作用的蛋白。TUNEL法染色法可以對單個凋亡細(xì)胞進(jìn)行原位染色，是檢測細(xì)胞凋亡的特異性和敏感性很高的方法。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CIH模型中大鼠的海馬神經(jīng)細(xì)胞中的Caspase-3蛋白表達(dá)會隨著CIH時間的長短而變化，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，而且相應(yīng)的過程能夠同神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程大致相同，這也就是說隨著Caspase-3蛋白的表達(dá)增多，能夠在很大程度上激活了Caspase家族的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，這才導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞開始出現(xiàn)過度凋亡的現(xiàn)象，這同時也說明了Caspase-3其實是參與了CIH大鼠的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程，這與國內(nèi)多數(shù)研究結(jié)果相一致。也提示我們不同的CIH持續(xù)時間對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有著一定程度的影響。

參考文獻(xiàn)

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[3]趙雅寧，王紅陽，李琳,等. 不同程度間歇性低氧對大鼠不同腦區(qū)Bax、Bcl-2表達(dá)的影響[J]. 中國老年學(xué)雜志，2015，35(1)：162-163.

[4]宋愛玲，曾奕明.慢性間斷性缺氧對小鼠腎組織結(jié)構(gòu)、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達(dá)的影響[J]. 國際呼吸雜志，2007, 27(11):808-812.

[5]吳雨嶺，余鴻，徐富翠.缺氧對鼠胚大腦神經(jīng)元c-Fos表達(dá)的影響及當(dāng)歸保護(hù)作用[J]. 陜西醫(yī)學(xué)雜志，2006，35(4)：391-393.

[6]Farias JG, Puebla M, Acevedo A,etal. Oxidative stress in rat testis and epididymis under intermittent hypobaric hypoxia: protective role of ascorbate supplementation[J]. Androl，2010，31:314-321.

(收稿：2016-01-04)

通訊作者△

【中圖分類號】R33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.002