新加達原飲對慢性乙型肝炎患者外周血樹突狀細胞的影響

王禮鳳 宋春蓉 曹寧 齊婧 魚富麗 鄭旭銳 惠毅

摘要：目的 觀察新加達原飲對慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血樹突狀細胞（DCs）的影響。方法 對20例CHB患者均給予新加達原飲治療，療程12周。于治療前及治療4、8、12周時采集抗凝外周靜脈血，分離擴增單個核細胞中DC，流式細胞法檢測DC表型，同步檢測患者丙氨酸氨基轉移酶（ALT）及HBV DNA水平，并以10例健康人作為正常對照。結果 與正常對照組比較，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR表達顯著下降（P<0.01）。經新加達原飲治療后，DCs表面分子表達水平均提高，在治療12周時最顯著（P<0.01）。與治療前比較，CHB患者治療后ALT升高，于治療8周時最顯著（P<0.01），治療12周時明顯下降（P<0.01）；HBV-DNA水平下降，治療12周時下降最顯著（P<0.01）。結論 CHB患者外周血DCs表面分子表達水平低下，新加達原飲能上調DC表型表達。

關鍵詞：慢性乙型肝炎；新加達原飲；樹突狀細胞

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.08.007

中圖分類號：R259.126.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）08-0024-04

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）引起的，以肝臟炎性病變為主的一種傳染性疾

基金項目：陜西省中醫管理局中醫藥科研課題（13-LC074）

病，宿主免疫狀態是決定乙型肝炎臨床轉歸和療效的最主要因素[1]。近年來國內外研究提示，造成慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）感染慢性化的機制與機體內樹突狀細胞（DCs）抗原遞呈功能缺陷，不能把病毒抗原的信號傳遞給機體的免疫系統有關[2-6]。新加達原飲是在明代醫家吳又可創立的達原飲基礎上，經過長期臨床實踐加減變化組成的經驗方，對CHB具有較好治療效果[7-9]。本研究以3個月為1個療程，觀察其對CHB患者外周血DCs的影響。現報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料

20例均為2013年7月-2014年12月陜西中醫藥大學第一附屬醫院門診患者。其中男14例，女6例，年齡20～54歲，平均年齡（32.4±10.2）歲，病程2～21年。另以10例健康人作為正常對照，均為陜西中醫藥大學第一附屬醫院職工。本研究經醫學倫理委員會批準。

1.2 診斷標準

CHB診斷依據2010年中華醫學會感染病學分會、肝病學分會聯合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標準[10]。

1.3 納入標準

符合上述CHB診斷標準，半年內未服用任何抗病毒藥物和免疫調節劑治療，且不屬于排除標準任何一項的病例。

1.4 排除標準

血清膽紅素≥34.2 ?mol/L；ALT>400 U/L；血清白蛋白≤30 g/L；重疊感染其他肝炎病毒（如甲、丙、丁、戊型肝炎病毒等），合并肝硬化、肝癌、脂肪肝；合并心腦、肺、腎等器質性疾病及造血系統嚴重疾病、精神病患者；年齡>65歲或<18歲妊娠或哺乳期婦女；未按規定服藥者。

2 方法

2.1 治療藥物

所有患者均服用新加達原飲散劑（草果6 g，檳榔10 g，黃芩15 g，白芍12 g，厚樸10 g，柴胡15 g，丹參20 g，姜黃10 g，葉下珠15 g，僵蠶10 g，蟬蛻10 g，靈芝10 g等，藥物飲片均購自北京同仁堂，經陜西中醫藥大學制藥廠凈化烘焙處理后，制成散劑），5 g，口服，每日3次。連續治療12周為1個療程。治療期間禁止服用任何其他抗病毒藥物和保肝降酶藥物。

2.2 主要試劑

淋巴細胞分離液，上海博升公司，批號20140506；重組人白細胞介素4（rh IL-4），美國Peprotech公司，批號20131103；重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rh GM-CSF），美國 Peprotech公司，批號20131217；RPMI-1640，吉諾生物醫藥技術有限公司；10%胎牛血清（fetal calf serum，FCS），美國Hyclone公司，批號20140123；熒光標記鼠抗人HLA-DR-PE（藻紅蛋白熒光素，批號20131220）、CD80-FITC（異硫氰酸熒光素，批號20131125）、CD86-PE（批號20131214）、CD1a-FITC（批號20140210），美國 ebioscience公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），江蘇寶萊公司，批號20140312；噻唑蘭（MTT，批號20131015）、二甲基亞砜（DMSO，批號20130925），美國Sigma公司。

2.3 觀察指標

于治療前及治療4、8、12周時，檢測患者肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶（ALT），熒光PCR法檢測HBV-DNA水平，流式細胞儀檢測CD80、CD86、HLA-DR、CD-1α。

2.4 樹突狀細胞培養及表型檢測

參照Romani等[11]分離培養DCs的方法稍作修改。無菌條件下抽取人外周血20 mL，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），PBS洗滌2次，RPMI1640洗滌1次。用含10% FCS RPMI 1640液調整外周血PBMCs濃度為3×106/mL，移植入6孔培養板，每孔3 mL。37 ℃、5%CO2條件下培養2 h，吸棄培養上清液，37 ℃預熱RPMI 1640液輕輕洗滌培養板2次，去除非貼壁細胞，即獲得貼壁的單個核細胞。向去除非貼壁細胞的6孔培養板每孔內各加10% FCS RPMI 1640培養液3 mL，其中含有GM-CSF 100 ?g/L、IL-4 500 U/mL，在37 ℃、5%CO2條件下培養，隔日換液1次，吸棄原液1.5 mL，加同體系培養液1.5 mL。收集第7日懸浮細胞，即為DCs，用PBS洗細胞2次，稀釋成5×105/ml，加入鼠抗人CD80-FITC、CD86-PE、HLA-DR-PE、CD-1α-FITC各20 ?L，輕輕混勻，4 ℃溫育45 min，再用PBS洗2次，流式細胞儀檢測DCs的表達。

2.5 統計學方法

采用SPSS12.0統計軟件進行分析。計量資料用 —x±s表示，組間均數比較采用方差分析，治療前后均數比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 治療前后患者肝功能及乙型肝炎病毒DNA比較

治療過程中，CHB患者ALT一度升高，于治療8周時升高明顯，但隨治療時間延長逐漸下降，于治療12周時基本恢復正常。治療后患者HBV-DNA水平下降。結果見表1。

3.2 正常對照組與慢性乙型肝炎患者治療前后樹突狀細胞表型表達比較

與正常對照組比較，CHB患者組外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達水平顯著下降（P<0.01）。給予新加達原飲治療后，CHB患者組外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達水平均升高，且在治療12周時最顯著（P<0.01）。結果見表2。

4 討論

DC是起源于骨髓的專職抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC），具有啟動T細胞介導的免疫應答功能，其功能狀態直接影響細胞和體液免疫應答。DC也是唯一可激活初始型免疫反應的細胞，是最強大的次級免疫反應的誘導物，是免疫應答的始動者。研究表明，CHB患者存在DC功能缺陷。HBV及其抗原可造成DC數量、表型和功能的異常[5，12]。CHB患者體內DC細胞功能缺陷，使HBV病毒粒子和抗原成分直接抑制DC細胞的表型成熟和功能活化，從而使DC細胞不能有效遞呈HBV抗原給T淋巴細胞[13]。對慢性HBV感染者的研究也發現，感染者外周血DC表面的CD1α、HLA-DR、CD80和CD86的表達水平低于健康者[14]。

中醫關于CHB發病機制正邪關系的論述，與現代醫學關于HBV感染造成機體免疫功能損傷，致病毒持續不能得到清除以使乙肝慢性化甚至導致肝硬化、肝癌發生的機制不謀而合。中醫認為HBV屬外感邪氣，從HBV引起急慢性肝炎的臨床表現來看，HBV同時具有濕、熱、毒邪的特點。HBV侵犯人體后，濕熱疫毒之邪蘊結中焦，影響肝膽脾胃的正常生理功能，致使脾胃失健、肝郁氣滯。日久邪氣結而不去，由氣入血，病久入腎，造成瘀血內停，肝脾腎虧損。脾為后天之本，腎為先天之本，是人體正氣的源泉和根本。HBV感染后虛實夾雜，濕、熱、毒、瘀互結，邪盛不斷傷正，正虛不能驅邪外出，形成惡性循環，遂致病情遷延難愈。新加達原飲正是基于這樣的病因病機認識創立的有效方劑，始終堅持扶正以助祛邪，祛邪不忘扶正，全面激發機體免疫應答發揮抗病毒作用。本研究發現，與正常對照組比較，CHB患者外周血DCs表面CD80、CD86、CD-1α、HLA-DR的表達顯著下降，經新加達原飲治療3個月，可以使患者DCs表面分子表達水平顯著提高。

研究中我們還觀察到，20例患者中有5例在開始治療時無任何癥狀，具有不同程度消化道癥狀者12例，僅感腰部酸困、失眠者3例。治療4周時，腰酸及失眠者癥狀消失，其他患者癥狀改善不明顯。在治療8周時，有8例患者訴納差加重，但隨著治療時間的延長，癥狀逐漸減輕；原來5例無癥狀患者中有4例在治療4周時出現大便溏、輕度腹脹，在治療8周時癥狀明顯，隨著治療時間的延長，癥狀減輕，至12周療程結束，所有患者癥狀基本消失。患者肝功能指標（ALT）在開始治療后均升高，但病毒水平并未出現相應增長，而是持續降低；隨著治療時間的延長，ALT逐漸恢復正常，此時病毒量進一步下降。在這一過程中并未增加任何保肝措施，由此推測，藥物通過上調DCs的功能，激發機體免疫應答，增強了機體正氣祛邪外出的能力，從而使濕熱伏邪不斷透出，引起或加重腹脹、便溏、納差等癥狀表現；同時發揮了抗病毒的作用，進而使肝細胞在病毒清除過程中暫時受到損害而致肝功能異常。

總之，新加達原飲可以通過增強DCs的功能而發揮抗HBV的作用，可以用于CHB的治療。本研究由于經費有限，觀察周期較短，尚無法全面揭示其抗病毒機制。在通過激發免疫應答徹底清除乙肝病毒這一治療過程中，免疫清除的重要標志——轉氨酶升高[15]是判斷療效和預后的重要指標。如何控制肝功能的異常程度即ALT升高的水平，才更加有利于抗病毒，獲得完全應答，還需要更多的研究來確定，以防止發生肝功能失代償現象。

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