黃瓜花蕾大小與花粉發育時期相關性研究

陳芬芬,　高　惠,　齊海軍,　金東淳

(延邊大學 農學院,吉林 延吉 133002)

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黃瓜花蕾大小與花粉發育時期相關性研究

陳芬芬,高惠,齊海軍,金東淳*

(延邊大學 農學院,吉林 延吉 133002)

摘要：以黃瓜花蕾為材料，用醋酸洋紅染色壓片法制片，在光學顯微鏡下觀察花粉的發育情況，并探討黃瓜花蕾大小與花粉發育時期的相互關系。結果表明：當花蕾長度小于0.3 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期和二分體時期；長度為0.3～0.6 cm時，為花粉發育的四分體時期；長度大于0.6 cm時，基本為花粉發育的后期。

關鍵詞：黃瓜；花蕾大小；花粉；發育時期；相關性

黃瓜 (CucumissativusL.) 為葫蘆科黃瓜屬，是一種重要的經濟作物，是世界主要蔬菜種類之一。利用常規育種手段選育黃瓜新品種不僅耗時耗力、效率低，同時也因黃瓜的種質資源相對匱乏、遺傳基礎相對狹窄，致使黃瓜新品種的選育進展緩慢，很難取得突破性進展。利用花藥或花粉離體培養方法誘導單倍體，進而培育出雙單倍體(DH),可大大縮短育種年限，提高育種效率，同時也為黃瓜基礎理論的研究提供了寶貴的基礎材料。

眾多通過花藥或花粉離體培養誘導單倍體的研究結果一致認為，植物通過花藥或花粉離體培養誘導單倍體時，花粉所處的發育時期是決定其成敗的關鍵因素，大多數植物花粉粒的單核靠邊期是最佳誘導時期。本研究通過對不同花蕾大小黃瓜花粉發育時期的觀察，探討花蕾大小與花粉發育時期的相關性，旨在為黃瓜花藥或花粉離體培養提供依據，以花蕾大小這一外觀形態標記來判斷花粉發育時期，提高取材的準確性和效率。

1材料與方法

1.1材料

2015年，將黃瓜種子[“綠玉”旱黃瓜(家昌種業)]經催芽、播種、育苗后，移栽至溫室中，等到開花盛期，采集新鮮的、不同大小的花蕾做試材。

1.2方法

黃瓜開花盛期，每天8:00～9:00，用鑷子采集新鮮的、不同大小的花蕾，用游標尺測量花蕾長度，按花蕾長度分6個等級(<0.3、0.3～0.6,0.6～0.9,0.9～1.2,1.2～1.5，>1.5；單位：cm)，不同等級的花蕾分別固定在卡諾固定液(無水酒精∶冰醋酸=3∶1)中，于4 ℃冰箱中固定24 h后，轉移至70%酒精中保存備用。為了確定不同大小花蕾的花粉發育時期，取出固定保存的花蕾，經蒸餾水充分清洗后，在解剖顯微鏡下，用鑷子小心剝去萼片、花瓣，取出花藥，將花藥放在載玻片上，用雙面刀片從花藥中部切斷，用鑷子輕輕擠壓捏碎花藥，分離出花粉粒，去掉花藥壁殘渣，滴1滴醋酸洋紅染色液，染色2～3 min，蓋上蓋玻片，用光學顯微鏡先在10×10下找視野，再在10×40的10×100下觀察不同長度花蕾中小孢子所處的發育時期并照相。必要時用45%的冰醋酸分色。

2結果與分析

通過對不同大小黃瓜花蕾的花粉發育時期的顯微觀察發現，黃瓜花蕾的大小與小孢子發育時期間有一定的相關性。該試驗將黃瓜小孢子的發育分為小孢子母細胞時期、二分體時期、四分體時期和花粉發育后期(圖1)。

(A:<0.3 cm;B:0.3～0.6 cm;C:0.6～0.9 cm;D:0.9～1.2 cm;E:1.2～1.5 cm;F: >1.5 cm)

2.1黃瓜花粉生長發育的形態描述

黃瓜小孢子的形成和花粉粒的發育與番茄[1]和辣椒[2]花粉粒的發育相似。小孢子母細胞發育前，核物質合成旺盛，表現為細胞著色較深，在小孢子母細胞的四周沉積一層胼胝質。小孢子母細胞減數分裂的結果先形成二分體，二分體再分裂，形成十字交叉形的四分體，四分體四周的胼胝質壁有規則地包囊著四分體。

包囊四分體四周的胼胝質被分解后，小孢子從中游離出來。剛游離出來的小孢子核位居中央，此期為單核中期，液泡不明顯，小孢子只有一層壁。隨著小孢子從四周汲取營養，細胞體積逐漸增大，液泡逐漸發育為大液泡，并將細胞核擠到邊上，此期為單核靠邊期。而后核不均等分裂為二，從而形成二核花粉，并進而發育為二細胞花粉粒。此期小孢子逐漸形成二層壁。

2.2黃瓜花粉發育時期與花蕾大小的相關性

按花蕾大小觀察每個等級花蕾的花粉粒發育特性結果表明，小于0.3 cm的花蕾中可觀察到處在花粉母細胞減數分裂期(圖2)和二分體時期(圖3)的花粉粒。有時在同一花藥制片中雖然頻率極小，卻也能觀察到已接近成熟的花粉粒(圖3-D)。雖然也不能排除污染的可能性，但此種情況不止一次出現，這與黃瓜花粉發育較同步[3]的結果不同。

圖2　小孢子母細胞時期

圖3　二分體時期，核分向兩極

花蕾大小為0.3～0.6 cm時，花粉粒處在四分體時期(圖4A-C)和單核花粉期(圖4D-H)。這一時期的花蕾中可以觀察到剛進入四分體時期而無明顯的胼胝質壁的四分體(圖4-A)、被胼胝質包圍的單核的四分體(圖4-B)、被胼胝質包圍的，分離出來

的四分體(圖4-C)和被分離出來的單?；ǚ哿?圖4-F、G)。這一時期的花粉?；旧弦研纬梢粚颖?圖4-F)，基本處于單核中期。不過在同一花藥制片中的同一個四分體中觀察到了二核、三核的花粉粒(圖4-D、E、G、H)。

A.四分體初期；B.四分體中期；C.四分體后期

花蕾大小為0.6～0.9 cm及以上時，黃瓜花粉粒趨于成熟，屬發育后期。此時期能觀察到已形成二層壁的，靠邊期的單核、二核花粉粒(圖5-A、B)。成熟的黃瓜花粉粒外觀特點為，外壁上可觀察到網紋狀結構(圖5-C)和萌發孔(圖5-D)，還可觀察到1～4個不同萌發孔數目的花粉粒(圖5-E、F)。

A.具有一個營養核和一個生殖核的雙核期；B.發育后期外壁上形成的網紋結構；

3討論與結論

培育單倍體，特別是通過雄核發育過程誘導單倍體在加快育種進程，提高育種效率方面具有重要意義。世界范圍內，雙單倍體(DH)技術廣泛用于新品種選育。如“Maris Haplona”油菜和“Mingo”大麥最早在加拿大普及[4-5],而最近“BRS 328”小麥在巴西、“Emerson”小麥在加拿大[6-7]、“Kharoba”小麥在摩洛哥普及[8]。已有超過300個以上來源于雙單倍體，100個以上的大麥、水稻品種和50個以上的油菜品種的選育報道。而體內誘導雙單倍體技術在玉米自交系生產中廣泛應用[9-10]。和大麥、玉米、燕麥、水稻、黑麥、小麥[10-15]、白菜類[16]和馬鈴薯[17]不同,在豆類[18]和根莖類植物[19]中，雙單倍體技術還沒達到引領其育種的水平。最近，改造染色體著絲點組蛋白結構來誘導染色體特異性消失，進而誘導雙單倍體的技術在擬南芥中首次報道[20-21]，而在香蕉、大麥、短柄草、木薯、棉花、百脈根、水稻、大豆、甜菜和煙草[22]中正在進行相關研究，然而至今還沒有相關的成功報道。包括黃瓜在內的植物花粉培養在理論和實際應用方面具有重要意義。

很多研究結果一致認為，通過花粉培養誘導單倍體時，有很多因素對單倍體的誘導效果產生影響，如基因型、花粉發育時期、脅迫處理、激素、培養基及培養條件等，其中，選擇適當的花粉發育時期是能否成功誘導單倍體的關鍵。為達到更簡便、有效地選擇適當發育時期花粉粒的目的，本文探討了黃瓜花蕾大小與花粉發育時期的相互關系。結果表明，當花蕾長度<0.3 cm時，花粉基本處于小孢子母細胞時期和二分體時期；長度為0.3～0.6 cm時，為花粉發育的四分體時期和單核花粉期；長度>0.6 cm時，基本為花粉發育的后期。從花粉培養的角度看，普遍認為單核靠邊期是花粉培養的最佳時期，而黃瓜的單核靠邊期一般集中在花蕾長度為0.6～0.9 cm，這一結果為本實驗室正在進行的黃瓜花粉離體培養研究提供了重要的參考。

據曹清河等[23]研究，黃瓜花粉粒為二核型花粉粒，同樣，本試驗中所觀察的所有的成熟花粉粒中也未發現三核型花粉粒，但在四分體時期卻不止一次地觀察到了三核花粉粒。當然，不能排除對成熟花粉粒的觀察數量不夠而產生遺漏的可能性，但從每一種植物的成熟花粉粒當中細胞核的數目是固定的(即植物可分為二核型和三核型)這一經典理論來看，黃瓜成熟花粉粒中同時存在二核、三核型花粉粒的可能性極小。因此，可以提出一種假設，即黃瓜花粉粒發育初期發生三核花粉粒，但因某種原因如營養過分消耗而中途消失，不能形成成熟的三核花粉粒。若這一假說成立，黃瓜又是一個研究相關花粉類型以及花粉發育機理的一個理想的模型植物。在這一時期(花蕾大小)，在同一個制片中可以觀察到被胼胝質包圍的四分體和成熟的花粉粒(圖4-I)，說明黃瓜花粉發育存在不同步性。本試驗中觀察到的在同一個制片中出現不同發育時期的花粉粒和四分體時期發現三核的花粉粒，這些與前人的研究結果不同或沒有過的特異現象，有待于今后進一步驗證。

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收稿日期：2016-03-21基金項目：國際合作研究項目(延邊大學—韓國農村振興廳國立園藝特作研究院)

作者簡介：陳芬芬(1988—)，女，山東微山人，在讀碩士，研究方向為植物組織培養。金東淳為通信作者， E-mail:jdc1200@ybu.edu.cn

文章編號：1004-7999(2016)02-0134-05

DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2016.02.008

中圖分類號：S642.2

文獻標識碼：A

Preliminary studies on the relationship between bud size and pollen development stages of cucumber

CHEN Fenfen,GAO Hui,QI Haijun,JIN Dongchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Abstract：In present study, the different length of buds of cucumbers (Cucumis sativus L.) as materials, pollen development stages were observed with light microscope by pollen staining with aceto carmine, and the relationships between the bud size and pollen development stages were studied. The results showed that the pollens were basically at the stage of microsporocyte and the peak stage of dyad when the size of buds was 0～0.3 cm, whereas the pollens were at tetrad, uninucleate, binucleate and trinuclear stages when the bud size were 0.3～0.6 cm. When the bud size was longer than 0.6 cm, the pollens were at the late stage of pollen development. Overall, it was more scientific that size and length of buds was used as a standard for determining the stages of microspore development.

Key words:Cucumber; bud size; pollen； development stage; correlation