致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

高智玲，紀　雪，陳　萍，郭學軍，劉　軍，祝令偉，周　偉，馮書章，孫　洋

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致病性嗜水氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

高智玲1,2，紀雪2,3，陳萍1，郭學軍2,3，劉軍2,3，祝令偉2,3，周偉2,3，馮書章2,3，孫洋2,3

1.吉林農業大學食品科學與工程學院,長春130118；2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所,長春130122；3.吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室,長春130122

摘要：目的了解長春地區水產品中致病性嗜水氣單胞菌流行菌株的分布及其耐藥情況。方法采用國標方法初步分離嗜水氣單胞菌，結合生化及分子生物學方法進行種屬鑒定并檢測毒力基因，測定致病株毒力及耐藥譜。結果319份樣品中共分離到279株嗜水氣單胞菌，分離率87.46%。毒力基因陽性株為24株，陽性率為8.60%，毒力基因陽性株全部為β-溶血并具有較強的細胞毒性。致病性分離株至少耐受4類抗生素，均為多重耐藥株。結論研究獲得了長春地區嗜水氣單胞菌的基本流行病學數據，探討了其毒力譜和多重耐藥模式，為嗜水氣單胞菌病防控措施提供了依據。

關鍵詞：嗜水氣單胞菌；毒力；耐藥性

Supported by the National 863 Project of China (No.2012AA022006), the National Science and Technology Major Project of China (No.2013ZX10004-217-002) and the Scientific and Technological Development Project of Jilin Province (Nos. 20140101032JC & 20150101110 JC)

Corresponding: Sun Yang, Email: sunyang10@hotmail.com

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬于弧菌科、氣單胞菌屬，屬嗜溫、有動力的氣單胞菌群[1]，是氣單胞菌的模式種[2]。在自然界中廣泛分布，普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中，根據其毒力差異，可分為致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物。臨床上，人類感染主要以急性出血性敗血癥為主要特征，慢性感染則主要表現為皮膚潰瘍或腸炎[3]，是一種典型人—獸—魚共患病病原[4]。該病原菌可對淡水養殖業造成嚴重的經濟損失，同時給人類的健康帶來嚴重的威脅，其公共衛生學意義已引起國內外廣泛關注和高度重視。近年來，隨著水產養殖業抗生素的濫用，該菌的耐藥性也在不斷增強并呈現較嚴重的多重耐藥性，其耐藥問題已成為影響水產養殖業發展和威脅人類健康的重要因素[5-7]。本研究針對長春地區淡水養殖魚類及市售淡水魚類采樣、分離嗜水氣單胞菌，并對其毒力及耐藥性進行研究，以期掌握致病性嗜水氣單胞菌的流行情況及耐藥譜變化，為淡水養殖業嗜水氣單胞菌病的防控提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源2014年采集長春市水產市場、超市、周邊養殖場及水庫魚的鰓拭子、腸道內容物、肝臟及魚養殖區水樣，共計319份。其中水產市場樣品188份，超市樣品65份，周邊養殖場樣品40份，水庫樣品26份。

1.1.2參考菌株及細胞株 嗜水氣單胞菌質控菌株ATCC 7966及Vero (CCL-81)細胞株由本室保存。

1.1.3培養基及試劑 RS培養基、RYAN培養基及生化反應管購自青島海博生物技術有限公司；MHA鑒定培養基購自法國梅里埃公司；DMEM培養液購自美國Thermo公司；藥敏紙片購自Oxoid公司；PCR Master Mix 緩沖液、DNA Maker為日本TaKaRa公司產品；引物和測序由invitrogen公司完成；新生胎牛血清購自四季青公司；胰酶為Gibco公司產品。

1.2方法

1.2.1樣品處理無菌操作剪取魚的肝、腸等樣品于試管中，加入2 mL無菌生理鹽水；水樣品取2 mL于試管中；鰓拭子于拭子管中加入2 mL無菌生理鹽水。以上樣品室溫振蕩10 min，使細菌充分洗脫，震蕩后靜置2～3 min。

1.2.2菌株分離培養參考GB/T 18652-2002方法[3]，吸取上清10 μL，20 μL生理鹽水稀釋后在RS瓊脂平板上半涂布，半劃線，28 ℃恒溫培養18～24 h，觀察菌落生長情況，若菌落光滑、微凸、圓整、黃色或淡黃色，并有特殊芳香氣味，則為疑似菌落。挑取單菌落劃線于RYAN氣單胞菌選擇培養基上進行二次純化，將菌落形態光滑、中間凸起有核、圓形、顏色綠色或深綠色的單菌落進行革蘭氏染色鏡檢。每樣品僅分離一株(所有分離株為非克隆株)。

1.2.3分離株PCR鑒定疑似菌落接種于LB液體培養基中，28 ℃振蕩培養過夜；吸取200 μL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，棄上清，加入200 μL ddH2O，混勻后100 ℃水浴10 min。冷卻后，12 000 r/min離心1 min，上清作為模板待檢。參考文獻[8-9]，針對氣單胞菌屬16S rDNA基因特異性片段，嗜水氣單胞菌16S rDNA基因特異性片段、溶血素基因、氣溶素基因合成了4對引物(表1)。PCR 反應體系：PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，引物各1 μL，ddH2O補至25 μL。氣單胞菌屬、氣溶素及溶血素檢測PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，59℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸7 min；嗜水氣單胞菌的特異性16S rDNA檢測PCR反應

表1PCR鑒定引物

Tab.1Primers used in this study

引物名稱Name引物序列(5'-3')Sequence(5'-3')基因位置Locationwithingene產物大小/bpSizeofproducts/bp參考文獻或登入號Referenceandno.ofGenBankAHH1FGCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT961-983130[9]AHH1RGAGCGGCTGGATGCGGTTGT1090-1071AH-aerAFCAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA1323-1344309M16495AH-aerARACGAAGGTGTGGTTCCAGT1631-1613A16SFGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGA1020-1041356X74677A16SRTCACCGCAACATTCTGATTTG1375-1355AH-16SFGAAAGGTTGATGCCTAATACGTA445-467685KP091884AH-16SRCGTGCTGGCAACAAAGGACAG1130-1110

注：AHH1，溶血素引物；AH-aerA，氣溶素引物；A16S，氣單胞菌16S rDNA屬特異性引物；AH-16S，嗜水氣單胞菌16S rDNA特異性引物。

Note: AHH1, Primers for gene of hemolysin; AH-aerA, Primers for gene of aerolysin; A16S, Primers forAeromonasspp.; AH-16S, Primers forAeromonashydrophila.

條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s ，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸5 min。1.5%的瓊脂糖進行凝膠電泳，凝膠成像系統觀察分析。

1.2.4生化鑒定及溶血試驗以細菌鑒定儀(BD PhoenixTM-100)對24株毒力基因陽性的氣單胞菌分離株進行鑒定。以微量發酵管進行生化鑒定，包括葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷，同時進行氧化酶試驗、AHM鑒定培養、運動性、吲哚試驗、蛋白酶試驗。并將分離株接種于含5%綿羊血瓊脂培養基上，以質控菌株為陽性對照，28 ℃恒溫培養24～28 h，觀察有無溶血現象。

1.2.5細胞毒性試驗24株攜帶毒力基因的分離株及10株毒力基因陰性分離株分別接種于5 mL腦心浸液肉湯，28 ℃培養箱中孵育16 h。將菌液于4 ℃ 8 000 r/min離心5 min，上清過濾除菌。以細胞培養液將細菌培養上清做2倍梯度稀釋，備用。將處于對數生長期的Vero細胞消化并計數，調細胞密度為104m/L，吸取細胞懸液加到96孔細胞培養板中，每孔100 μL，5% CO2，37 ℃，恒溫孵育24～48 h，待細胞長至80%后，向每孔中添加100 μL不同稀釋度培養上清。每株菌毒素上清設7個梯度，每個梯度設3個重復，于5% CO2，37 ℃恒溫孵育24～72 h，倒置顯微鏡(×40)觀察細胞病變狀況。同時設置空白對照、陰性對照(腦心浸液肉湯)及陽性對照(ATCC 7966培養上清)。

1.2.6藥物敏感性試驗以細菌鑒定儀(BD PhoenixTM-100)測定分離株耐藥譜。儀器不能測定的抗生素采用Kirby-Bauer紙片擴散法，依據CLSI標準[10]判定耐藥水平。

2結果

2.1初步分離鑒定經RS培養基初步分離、RYAN培養基二次純化后得到279株疑似嗜水氣單胞菌分離株。均為革蘭氏陰性、兩端鈍圓的短桿菌。氣單胞菌屬特異性16S rDNA引物PCR鑒定均為陽性。嗜水氣單胞菌特異性16S rDNA引物PCR鑒定205株為陽性，74株為陰性。

2.2毒力基因檢測結果實驗獲得的擴增片段大小與預期結果一致。297株分離菌毒力基因PCR檢測有24株攜帶溶血素和/或氣溶素基因(大多數分離株同時攜帶氣溶素與溶血素2種基因，3株菌只攜帶一種毒素基因)。其中22株嗜水氣單胞菌特異性16S rDNA檢測陽性(表2)。

表2　毒力基因陽性株鑒定結果

注：“+”陽性；“-”陰性；“—”無鑒定結果。

Note: “+” Positive; “-” Negative; “—” No result.

2.3毒力基因陽性菌株鑒定結果 細菌鑒定儀對這24株菌鑒定結果顯示，13株為嗜水氣單胞菌，10株為溫和氣單胞菌，1株為豚鼠氣單胞菌。根據《伯杰細菌鑒定手冊》對24株菌進行鑒定，氧化酶試驗、葡萄糖發酵均陽性，4株水楊苷陰性，AHM鑒定培養及阿拉伯糖發酵試驗中分別有2株為陰性，蔗糖和七葉苷發酵試驗中分別有1株為陰性，據此結果判定，24株毒力基因陽性分離株中15株為嗜水氣單胞菌。此外，蛋白酶試驗、運動性及溶血試驗均為陽性，且均為β-溶血(表2)。

2.4細胞毒性試驗結果24株攜帶毒力基因的氣單胞菌培養上清作用于Vero細胞，均觀察到細胞皺縮、脫落及形態變圓等細胞毒性反應。最短在培養上清液作用6 h后，細胞發生空泡效應；72 h后細胞脫落、破碎，死亡；對照組細胞正常。24株毒力基因陽性分離株培養上清致細胞病變的最大稀釋倍數在29～218之間，10株毒力基因陰性分離株培養上清致細胞病變的稀釋倍數均為2倍，陽性質控菌株細胞毒性反應的最大稀釋倍數為218。有6株菌的細胞毒性較高，在215倍稀釋度及以上，菌株AH-10毒力最強，細胞毒性反應的稀釋倍數為218。只攜帶1種毒力基因的分離株AH-8、 AH-11及 AH-22的細胞毒性反應的稀釋倍數分別為217、216和213。不同分離菌株的上清液對細胞毒性存在差異，結果統計如圖1。

注：稀釋梯度值為X，log2X-1為橫坐標，即9代表1∶29；稀釋梯度10代表1∶210；稀釋梯度11代表1∶211；以此類推。X as the value of dilution gradient, log2X-1 as the absciss, 9 representatives dilutions of 1∶29; 10 representatives dilutions of 1∶210; 11 representatives dilutions of 1∶211; and so on.圖1　細胞毒性試驗結果Fig.1　Result of cytotoxic assay

2.5藥物敏感性試驗結果測試的26種抗生素包括β-內酰胺類與β-內酰胺酶抑制劑、氨基糖苷類、大環內酯類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類、林可霉素類和四環素類抗生素。24株攜帶毒力基因的氣單胞菌對其中8種抗生素全部敏感，對7種抗生素完全耐藥(表3)。對青霉素類的氨芐西林、青霉素完全耐藥，對哌啦西林耐藥1株；對頭孢菌素類的頭孢噻吩、頭孢唑林全部耐藥，對頭孢西丁耐藥率達到41.70%(10株)，對頭孢曲松、頭孢噻肟及頭孢噻肟克拉維酸敏感；對于氨基糖苷類藥物中的鏈霉素耐藥，對慶大霉素、阿米卡星敏感；對喹諾酮類藥物環丙沙星耐藥性較左氧氟沙星嚴重，耐藥率為16.67%(4株)；對大環內酯類的紅霉素耐藥性達到了87.50%(21株)，對阿奇霉素的耐藥率為37.50%(9株)；對克林霉素完全耐藥；對四環素、復方新諾明耐藥率分別為20.83%(5株)和25.00%(6株)；對氨曲南、氯霉素的較為敏感；對碳青霉烯類抗生素全部敏感。總體分析，受試菌株對4類及以上抗生素具有耐藥性，均為多重耐藥菌，其中耐5類抗生素的菌株數最多，耐藥譜最廣的菌株能夠耐受8類抗生素(圖2)。

圖2　不同耐藥類型的菌株統計結果Fig.2　Statistical results of different resistant strains

3討論

嗜水氣單胞菌對魚等冷血動物和溫血動物均有致病性，是典型的人和水生動物的共患病原菌。該菌本身及其產生的毒素對食品安全提出了嚴峻的挑戰。很多國外學者利用PCR方法以16S rDNA為目的基因對嗜水氣單胞菌進行鑒定，但該方法亦有其局限性[11]。本研究根據Wang[8]等人的方法分離出的24株攜帶毒力基因的氣單胞菌中，利用Dorsch[9]等的方法嗜水氣單胞菌的檢出率為91.67%(22株)，微生物鑒定系統陽性結果為54.17%(13株)，傳統生化鑒定16株(66.7%)為嗜水氣單胞菌。因此，若要更準確地檢出嗜水氣單胞菌，還應結合嗜水氣單胞菌的生長特性及生化指標進行鑒定。

嗜水氣單胞菌的致病性與其毒力因子密切相關，目前發現的嗜水氣單胞菌毒力因子很多，但多數報道認為外毒素為嗜水氣單胞菌的主要致病因子[12]。PCR方法作為敏感特異的檢測手段得到廣泛應用[13]。本研究以嗜水氣單胞菌的溶血素和氣溶素作為毒力標志物進行了PCR檢測，并以細胞試驗測定其毒力。試驗結果全部毒力基因陽性株培養上清均具有很強的細胞毒性作用，而隨機抽取的10株毒力基因陰性株培養上清對vero細胞毒性較弱，證明可以利用氣溶素和溶血素為毒力標志物判定分離株毒力，或用于建立致病性嗜水氣單胞菌的檢測方法。本研究對長春地區淡水養殖魚類嗜水氣單胞菌的攜帶情況進行了初步調查，結果顯示該菌廣泛存在于市售淡水魚及水產養殖環境中，且致病性嗜水氣單胞菌占有比例較高，提示人類有通過接觸或食用受污染的生鮮水產品而感染致病性嗜水氣單胞菌的風險，應引起重視。

表3　致病性嗜水氣單胞菌對26種抗菌藥物的敏感性

注：[a]為KB紙片擴散法測得結果。

Note:[a]Results from Kirby-Bauer Test.

本研究分離的致病性嗜水氣單胞菌對一代頭孢的耐藥率較高，對三代頭孢比較敏感，這與蔡麗娟[6]和Ko[14]等報道一致，頭孢唑林耐藥水平較曲芬[15]等報道的48%的耐藥率差距較大；對青霉素，氨芐西林完全耐藥，耐藥水平與朱秀芝[16]等其他學者報道的研究結果相近[17-20]，其耐藥情況甚為嚴重(96%～100%)，本研究中克林霉素耐藥率為100% ，這可能與嗜水氣單胞菌固有耐藥性有關[21]。相較于王靜波[22]報道的北京地區嗜水氣單胞菌的耐藥情況，本研究結果對磺胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗生素耐藥率偏低，而與王友娟[23]報道的遼寧地區耐藥水平相比，各種抗生素耐藥水平均呈上升趨勢，特別是鏈霉素、紅霉素等抗生素，耐藥率分別從8.4%及42.7%上升到了100%與87.5%。且分離到的毒力基因攜帶株至少耐受4類抗生素，58.3%(14株)的菌株耐受5類抗生素。這與淡水養殖場普遍、高頻度使用這幾種抗菌素有關，不同養殖區域、養殖品種、用藥方法及用量也導致了耐藥性的差異。

總之，無論是水產養殖，還是臨床治療，合理使用抗生素已成為當務之急。臨床上應盡量根據藥敏試驗結果確定使用抗生素的種類和劑量，同時應加強水產養殖中抗生素的合理使用，控制多重耐藥菌株的產生和流行。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.016

通訊作者：孫洋，Email: sunyang10@hotmail.com

中圖分類號：R378

文獻標識碼：B

文章編號：1002-2694(2016)04-0400-06

收稿日期：2015-07-09修回日期：2015-12-10

Identification and antimicrobial resistance of pathogenic Aeromonas hydrophila

GAO Zhi-ling1,2, JI Xue2,3,CHEN Ping1,GUO Xue-jun2,3,LIU Jun2,3,ZHU Ling-wei2,3,ZHOU Wei2,3,FENG Shu-zhang2,3,SUN Yang2,3

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.InstituteofMilitaryVeterinary,AMMS,Changchun130122,China;3.KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun130122,China)

Abstract:The occurrence of antimicrobial resistance and prevalent distribution of pathogenic Aeromonas hydrophila from aquatic products was investigated in this study. A total of 279 strains were isolated from 319 samples from commercially available freshwater fish and aquaculture farms in Changchun area, in which virulence genes were detected by PCR assays. Among them, 24 strains were positive (8.06%). Most of them carry both genes of hemolysin (hly) and genes of aerolysin (aerA). Biological characteristics and drug resistance spectrum of the pathogenic Aeromonas hydrophila isolates were characterized and identified. The 24 strains could cause β-hemolytic with positive protease test. To evaluate cytotoxicity by vero cell lines, the culture supernatant of the 24 strains resulted in severe cytopathogenic effect. All of pathogenic Aeromonas hydrophila isolates were resistant to at least 4 kinds of antibiotics. The results showed that all of the pathogenic strains had multiple resistance patterns. The investigation provided basic data for preventing and controlling the transmission of Aeromonas hydrophila with the multi-drug resistant.

Keywords:Aeromonas hydrophila; virulence; drug resisitance

863項目(No.2012AA022006)；國家科技部傳染病重大專項(No.2013ZX10004-217-002)和吉林省科技計劃項目(No.20140101032JC，20150101110JC)聯合資助