加拿大棘球絳蟲的基因分型與分子流行病學研究進展

李雙男，閆鴻斌，李　立，婁忠子，付寶權,2，殷　宏,2，賈萬忠,2

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加拿大棘球絳蟲的基因分型與分子流行病學研究進展

李雙男1，閆鴻斌1，李立1，婁忠子1，付寶權1,2，殷宏1,2，賈萬忠1,2

1.中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/農業部獸醫公共衛生重點實驗室甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室, 蘭州7300462.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州225009

摘要：通過比較加拿大棘球絳蟲不同基因型的線粒體基因組，尤其是其中的cox1和nad1基因核苷酸序列的差異性，了解加拿大棘球絳蟲各基因型的分子遺傳標記特征與變異情況，闡明加拿大棘球絳蟲基因型在棘球屬中的分類地位、命名和進化關系。另外，本文通過對加拿大棘球絳蟲各基因型的分子流行病學特征、研究意義、未來研究方向等進行綜述，為從事該領域研究的學者和臨床工作者提供豐富的分子流行病學信息或資料，并為棘球蚴病分子流行病學調查、預警預報和綜合防治策略的制定等提供理論依據和指導。

關鍵詞：加拿大棘球絳蟲；基因型；分子遺傳標記；線粒體基因；分類學；流行病學

Supported by the Gansu Provincial Key Project of Scientific and Technical Supporting Projects (No. 1203NKDA039), the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (Nos. 200903036-07, 201303037, 201503-047), the Science Fund for Creative Research Groups of Gansu Province(No. 1210RJIA006), and the NBCITS MOA (No. CARS-38)

細粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus)隸屬于絳蟲綱、帶科、棘球屬(Echinococcus)，其中絳期幼蟲—細粒棘球蚴是引起人和家畜棘球蚴病的病原體。由于地理分布上的差別和對宿主適應性的不同，細粒棘球絳蟲在長期的進化過程中，其遺傳物質發生了變異和進化[1]。細粒棘球絳蟲種內變異現象突出，其分類和命名正發生著顯著的變化。一些新的分子生物學和流行病學數據表明，先前命名的細粒棘球絳蟲蟲株或基因型(如G1—G10)中的一些必須被單獨視為物種[2-3]。造成這種分類與命名變化的原因除了遺傳距離上的差異以外，主要是在同一地區這些類群保持著遺傳穩定性和宿主特異性方面的差異[4]。研究人員通過對分離株樣品線粒體細胞色素c氧化酶亞基1(Cytochrome c oxidase subunit 1,cox1)和NADH脫氫酶亞基1(NADH dehydrogenase subunit 1,nad1)以及核糖體RNA基因(rDNA)的部分片段序列、線粒體基因組(mitochondrial genome, mt genome)序列等分子遺傳標記特征，成功地對細粒棘球絳蟲不同蟲株進行了基因分型、進化關系分析、重新分類等。有學者建議將細粒棘球絳蟲G1—G3基因型定名為細粒棘球絳蟲狹義種(其中G1就是常見的綿羊株)，而G4—G10型定名為細粒棘球絳蟲廣義種，其中G4定名為馬棘球絳蟲(E.equinus)，G5定名為奧氏棘球絳蟲(E.ortleppi)，G6—G10定名為加拿大棘球絳蟲(E.canadensis)[5]。這種依據寄生蟲的基因型特征的分類與命名對明確其在包括人在內的中間宿主之間的傳播方式與開展分子流行病學調查上非常重要。本文主要通過綜述加拿大棘球絳蟲的基因分型、各基因型的分子遺傳標記、宿主范圍、對人和動物的致病力、流行病學意義等方面的差異，從而給棘球蚴病流行病學調查、預警預報、綜合防控措施的制定、診斷試劑和疫苗的研發等提供重要依據和指導意義。

1基因分型的分子鑒定方法

目前已有多種分子生物學方法用于研究細粒棘球絳蟲的變異研究與基因分型，其方法主要有限制性片段長度多態性、聚合酶鏈式反應連接的限制性片斷長度多態性、隨機擴增多態性DNA、擴增片斷長度多態性、單鏈構象多態性、DNA序列分析、微衛星DNA等，本文主要針對加拿大棘球絳蟲的常用分類研究方法作簡要概述。

1.1聚合酶鏈式反應連接的限制性片斷長度多態性(PCR-RFLP)PCR-RFLP的原理是用一對特異的引物對基因組DNA某一段序列進行PCR擴增，擴增產物用限制性內切酶消化，經瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色后，在紫外光下進行檢測。與常規的RFLP相比，該方法具有快速簡便、成本較低等優點。Rosenzvit等[6]對細粒棘球絳蟲進行rDNA的PCR-RFLP分析，首次發現G6基因型對人體具有感染性。

1.2DNA序列分析DNA序列中含有豐富的進化信息，不同的生物種類存在不同的DNA序列，且具有穩定性。G7基因型具有獨特的DNA特征，可與其他基因型相區別。G7基因型主要寄生于豬的肝臟、肺臟，其他內臟少見，對豬有高度感染力，對羊感染力低。Okamoto等[7]對多個棘球絳蟲蟲株cox1基因部分片段(391 bp)的核苷酸序列進行了對比研究，結果發現其種間核苷酸序列差異超過12%。Bowles等[8]通過mtDNA的nad1基因序列分析和rDNAITS1(核糖體RNA基因的內轉錄間隔區1，ITS1)的PCR-RFLP分析，鑒定出了一種新的基因型即G8。利用此方法，Lavikainen等[9]在芬蘭發現了另一種新的基因型G10。分子生物學技術的發展極大地促進了細粒棘球絳蟲蟲株鑒定的深入研究。隨著科技的發展，鑒定蟲株變異情況的方法也日益增多，研究人員可以根據需要選擇快捷簡便的分型方法或者遺傳變異分析方法。使用核DNA的調查多涉及核基因組區域，比如Bowles和McManus等人[8]對ITS1的研究，Bart等人[10]使用編碼抗原B/1、BG1的基因DNA探針以及肌動蛋白III基因等，Moro等[11]對伸長因子1α的研究以及Scott和McManus[12]對隨機擴增多態性DNA標記的研究等。此外，使用線粒體基因進行遺傳變異的分析，大多涉及到cox1和nad1基因序列的測定[13-14]，聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性或者PCR-RFLP分析以及12S rRNA、atp6基因乃至線粒體全基因組的序列分析[15-19]。這些方法都被證明能有效分析棘球絳蟲的蟲株變異和進行基因分型。隨著科技的發展，用于鑒別蟲株遺傳變異分析和基因分型的方法也日益增多，研究人員可以根據需要選擇快捷簡便的方法。

2G6—G10基因型的分子遺傳標記特征

2.1線粒體基因cox1和nad1基因部分序列比較

目前有許多分子遺傳標記用于加拿大棘球絳蟲基因分型的研究，但是對cox1和nad1基因片段部分核苷酸序列的研究應用最廣泛。G6(駱駝株)、G7(豬株)和G9(豬株)基因型之間以及G8(鹿株)和G10(麋鹿株)基因型之間核苷酸序列相似性很高。G6最早是由Wachira等人在駱駝和山羊體內發現并命名的[20]。G6(GenBank登錄號：AB208063)、G7(AB235847)、G8(AB235848)和G10(AB745463)cox1和nad1基因核苷酸序列間的差異性比較見表1。

表1加拿大棘球絳蟲各基因型cox1和nad1序列差異性比較

Tab.1Differences of the cox1 and nad1 sequences among E. canadensis genotypes

基因型(蟲株)Genotype(strain)駱駝株(G6)Camelstrain(G6)豬株(G7)Pigstrain(G7)鹿株(G8)Cervidstrain(G8)麋鹿株(G10)Fennoscandiancervidstrain(G10)駱駝株(G6)Camelstrain(G6)-0.0060.0320.021豬株(G7)Pigstrain(G7)0.003-0.0350.027鹿株(G8)Cervidstrain(G8)0.0330.035-0.029麋鹿株(G10)Fennoscandiancervidstrain(G10)0.0200.0220.035-

注：“-”線之上的數據為nad1基因核苷酸序列比較的結果，而“-”線之下的數據為cox1基因核苷酸序列比較的結果。

Note: Dates above the line "-" are the results ofnad1 gene sequences comparisons, and dates under the line "-"are the results ofcox1 gene sequences comparisons.

由表1可知，G6—G10基因型線粒體序列差異不大，cox1序列和nad1序列相似性均達95.6%以上。盡管如此，加拿大棘球絳蟲的分類地位仍有爭議，從表中也可看出G6與G7基因型cox1序列和nad1序列相似性最大。Thompson認為G6和G7應被分為加拿大棘球絳蟲中間型[21]。但是，這種命名似乎不太合適，因為對加拿大棘球絳蟲中間型的原始描述沒有涉及中間宿主的特異性[22]。目前還沒有任何關于中間型G6或G7的形態、遺傳、生態研究。因此，基因型G6—G10的比較遺傳學研究是加拿大棘球絳蟲重新分類的前提，也是明確不同論文間差異的依據[15，21，23-25]。至于Scoot等人關于G9基因型的報道至今還尚未被證實，因為至今尚沒有機會對其進行更深入的研究[26-27]。就總體研究來看，目前的證據支持棘球絳蟲的分離株G6、G7、G8和G10基因型是獨立進化譜系，因此將其合并為加拿大棘球絳蟲有一定的依據。

2.2線粒體基因組序列的比較除了cox1和nad1基因片段部分核苷酸序列的研究外，我們從NCBI數據庫中下載加拿大棘球絳蟲線粒體基因組的全部基因，并對每個基因變異位點進行分析，其基因組序列變異位點比較見表2。

表2加拿大棘球絳蟲線粒體基因組序列的比較

Tab.2Comparison of mt genome sequences among E. canadensis genotypes

基因Gene總位點Totalsites始末位點Sitesofbeginningandend保守位點Conservedsites變異位點Variablesites變異位點比例(%)Proportionofvariablesites(%)nad51572554-21251476966.11cox36482374-3021615335.09cob10683090-41571019494.59nad4L2614173-443325383.07nad412604394-56531191695.48atp65135848-6360483305.85nad28826369-7250848343.85nad18937481-8374851424.70nad33488661-900834171.82cox116089157-107641534744.60cox257612593-13168554223.82nad645613254-13709431255.48srRNA72611867-12592711152.07lrRNA97810824-11801955232.35

對G6—G10基因型線粒體基因組序列比較，從基因變異位點分析結果可以看出，nad3基因的保守性最高，變異位點的比例僅為1.82%；srRNA、lrRNA、nad4L、cox2、nad2等5個基因的變異位點的比例介于2%～4%之間；cob、cox1、cox3、nad1、nad4、nad6、atp6等7個基因的變異位點的比例介于4%～6%之間,其中atp6的差異達5.85%；nad5基因變異位點的比例最高，達到6.11%。因此，nad5和atp6等基因可以作為備選的分子標記用于棘球屬絳蟲的遺傳學研究中，這為合理利用其生物資源提供了依據和指導。

3G6—G10基因型分子流行病學意義

對棘球絳蟲進行準確基因分型，目的在于明確診斷結果，便于收集和分析病原體傳播途徑和對人體易感基因型的信息與數據。Sweatman[28]認為加拿大棘球絳蟲廣泛分布于有狼出沒的加拿大其他地區，而加拿大的沿海諸島和紐芬蘭被報道狼已滅絕。至于北極群島地區，因惡劣的環境條件以及低密度的中間宿主形成了加拿大棘球絳蟲在狼和蹄類動物間傳播的天然屏障。對于人體棘球蚴病例，加拿大棘球絳蟲G6—G10均可不同程度感染人[14，26，29-31]。G6—G10基因型的宿主及地理分布見下表(表3)。

表3加拿大棘球絳蟲分子流行病學資料匯總

Tab.3Summary of molecular epidemiology of E. canadensis

蟲株/基因型Strain/Genotype中間宿主Intermediatehost終末宿主Definitivehost地理分布Distribution參考文獻References駱駝株(G6)Camelstrain(G6)駱駝、山羊、綿羊、牛、人Camels,Goats,Sheep,Cattle,Human犬、狼Dogs,Wolves中東、非洲、中國、阿根廷、加拿大、蒙古、俄羅斯MiddleEast,Africa,China,Argentina,Canada,Mongolia,Russia[29,32]豬株(G7)Pigstrain(G7)豬、野熊、海貍、牛、人Pig,Wildbear,Beaver,Cows,Human犬、狼Dogs,Wolves歐洲(匈牙利、波蘭、斯洛伐克、意大利)、前蘇聯、南非、加拿大、巴西、葡萄牙、蒙古、墨西哥、中國Europe(Hungary,Poland,Slovakia,Ita-ly),theformerSovietUnion,SouthAfri-ca,Canada,Brazil,Portugal,Mongolia,Mexico,China[14,33-34]鹿株(G8)Cervidstrain(G8)駝鹿、馬鹿Moose,Reddeer狼,犬Dogs,Wolves南美、歐亞大陸、加拿大、俄羅斯、美國SouthAmerica,Eurasia,Canada,Russia,theUnitedStates[30,35-36]豬株(G9)Pigstrain(G9)豬Pig犬Dogs波蘭、加拿大Poland,Canada[26]麋鹿株(G10)Fennoscandiancer-vidstrain(G10)駝鹿、馴鹿、馬鹿Moose,Reindeer,Reddeer狼,犬Dogs,Wolves加拿大、芬蘭、瑞典、愛沙尼亞、蒙古、俄羅斯、美國、中國Canada,Finland,Sweden,Estonia,Mon-golia,Russia,theUnitedStates,China[30-32]中間型(G6/G7)Intermediatestrain(G6/G7)豬Pig野熊Wildbears法國France[37]

由表3可知，G6—G10復合群有著廣泛的宿主類型和地理分布。與其他細粒棘球絳蟲不同，加拿大細粒棘球絳蟲主要分布在加拿大，有調查表明，在包蟲病記錄的93頭鹿中，42%是麋鹿，37%是駝鹿，14%是北美馴鹿，6%是白尾長耳鹿和騾鹿。這些感染動物中，有83%只在肺中檢測到包囊，8%在肺和肝臟都能檢測到包囊，3%只在肝臟中檢測到包囊，6%在其他器官中檢測到包囊[29]。這些數據的記錄可以有助于我們全面了解加拿大細粒棘球絳蟲的生態、遺傳多樣性、基因型與致病性。根據加拿大棘球絳蟲感染記錄，相比于有蹄動物，駝鹿、麋鹿和馴鹿因在狼多的地方生存而有較高的發病率和感染強度，被認為是加拿大細粒棘球絳蟲的適宜中間宿主[30-31，38]。包括氣候變化、遷移、宿主滅絕以及土地利用變化在內的諸多因素影響加拿大棘球絳蟲的發病率和地域分布[29]。有報道表明加拿大棘球絳蟲可以中度感染人類[4，15，21，29，38-39]。最近分子研究發現加拿大棘球絳蟲引起的包蟲病病例在駱駝等牲畜，包括牛，豬和山羊在內的地區分布廣泛，尤其在蒙古和西伯利亞，包蟲病是常見的疾病[40]。

有關加拿大棘球絳蟲感染人類的情況見表2所示。其中G6基因型被列為人類感染包蟲病除G1基因型(普通綿羊株)外的第二個常見基因型，關于人類感染G6基因型的報道最早來自于阿根廷地區。到目前為止，有7個國家報道人感染G7型(表3)，有12個國家的其他5個物種可以作為其中間宿主。G7基因型的傳播似乎主要限于某些地區的中心(其中包括波蘭和波羅的海和東歐，其中最常見的中間宿主是豬)。一般來說，在全世界范圍內G7型在人或者動物的感染不像G1一樣普遍。盡管只有少數人類包蟲病呈現明顯的特征，G7基因型仍被認為是來自波蘭和斯洛伐克的唯一感染人的包蟲病例[27，41]。經鑒定在波蘭，奧地利和前南斯拉夫人感染G7型病例分別占100%(30/30)、92.0%(23/25)和33.3%(9/27)[29，52]。最近，非洲首例感染人類的G7基因型病例在南非發現[42]。另外有報道發現G8基因型感染人類的病例[43]，流行病學數據也表明G8基因型傳染人類[30]。至于G10基因型感染人類的病例也于2010年和2014年在蒙古和西伯利亞，2013年于俄羅斯報道出現過[40，44-45]，在烏蘭巴托國際病理學中心證實的人類包蟲病例中，通過分析其cox1序列確定這些病例主要感染的是加拿大棘球絳蟲(72.1%)或是棘球絳蟲狹義種(27.9%)，而感染加拿大棘球絳蟲的病例中，以G6和G7株居多。通過數據分析表明加拿大棘球絳蟲感染兒童較為普遍。調查的兒童病例中感染加拿大棘球絳蟲的比例為100%，烏蘭巴托的16個包蟲病患者中13例為加拿大棘球絳蟲，感染率為81.3%，而這13個疾病中有9名兒童，占69.2%，該研究首次證明該病的感染與年齡有關但具體原因尚不明確[40]。

在北緯和一些土著地區，生活在駝鹿和狼并存的區域附近的人感染包蟲病仍然是一個公共健康問題[46]。最近報道，加拿大囊性包蟲病的年總發病率估計為每百萬人中有0.72例感染。然而，由于臨床病例難以確診，這樣的感染率很有可能被低估[47]。在布加勒斯特，羅馬尼亞分離的60株細粒棘球絳蟲樣本中，發現有一例加拿大棘球絳蟲病例來自于人[48]，加拿大棘球絳蟲的傳播和分布可能會因氣候和景觀變化而加快，加之旅游和貿易日益全球化，國家對這類寄生蟲的檢測將對人和動物的健康發揮重要作用[49]。

4我國的流行情況

包蟲病是在中國感染人類的主要寄生蟲病之一。在我國，四川、新疆等地也有報道發現G6，也有研究結果表明G3、G6基因型存在于青海省的牦牛和綿羊，所分離出來的G6型與哈薩克斯坦、伊朗(駱駝)分離株nad1基因序列完全一樣。

目前已有27個省、自治區、直轄市報道過人類包蟲病例，中國西部和西北部是主要流行區[50-51]。黑龍江省在我國東北，雖然不是包蟲病的主要流行區，但是自從1958年首次報道人類感染包蟲病病例以來，尤其是近幾年，醫院包蟲病患者數量一直在增加。事實上早在2000年我國黑龍江省就已經被報道有4.5%的豬感染包蟲。根據之前的關于棘球蚴病分子流行病學數據的總結，豬是G7型的主要中間宿主，在豬中占的比例最高為82.8%。在這之前我國未出現人感染加拿大棘球絳蟲G7型的報道，這可能是由于最近二十年不斷增加的國際貿易和牲畜貿易及進口犬的數量不斷增加[53]。隨著研究的進一步深入，我國的黑龍江省也首次報道在病人體內檢測到G10基因型[54]，但患者除了輕度的上腹部不適外，并無任何顯著的臨床表現，該報道的發布進一步表明了加拿大細粒棘球絳蟲的地域分布遠比預期的廣泛，G10基因型病例可能會隨著人口的增長擴展到新的地理區域(特別是自然棲息地)，因為在這些地方人們直接或間接接觸野生肉食動物的機會大大增加。此外，即使是在我國，越來越多的國際旅行也為棘球絳蟲的復雜變種提供潛在的可能性。為了確認加拿大棘球絳蟲G10基因型的真正傳播模式，有必要在未來于野生動物宿主中檢測該寄生蟲，確認其生活史或者循環傳播模式[54]。

5在疫苗和診斷制劑研制與開發上的意義

隨著現代社會的發展，人口流動增加，寵物(犬)和經濟動物(狐貍)養殖數量增加，導致加拿大棘球絳蟲感染的增多。世界許多國家均投入大量的人力、物力、財力，通過各種途徑開展棘球蚴病的防治研究，疫苗防治可能是徹底控制該病流行的最有效的方法之一。EG95蛋白、EgM家族、抗原B、EgA31、GST、EF1等都是具有發展前景的候選疫苗抗原，其中以EG95蛋白制成的基因工程亞單位疫苗，無論是實驗動物的多樣性還是試驗地域的廣泛性都優于其他抗原。

對于不同基因型的細粒棘球絳蟲的EG95基因的研究發現，可以從加拿大棘球絳蟲的G6/G7基因型中擴增出與細粒棘球絳蟲狹義種G1/G2基因型EG95-1序列相似性為97.5%的基因(EG95-a1)。EG95-a1的氨基酸序列與EG95-1只有7個位點不同，且EG95-a1比EG95-1多一個與糖基化有關的N-X-S/T位點序列，二級結構多一個β片層，這些變化都說明EG95-a1可能與EG95-1的構象不同，也就是說EG95-1疫苗對加拿大棘球絳蟲G6/G7基因型的交叉保護作用可能減少或消失[55-56]。最近的研究也顯示來自G6型的EG95蛋白與免疫G1型EG95蛋白的綿羊產生的抗體不能全部結合[57]。因此，對細粒棘球絳蟲進行分型定種對疫苗和診斷試劑的研制和開發是十分必要的。

6未來研究方向的展望

G6—G10基因型在終末宿主如犬或狼體內的感染情況尚不十分清楚，這需要今后進一步對不同地理區域終末宿主體內的G6—G10基因型進行調查與分析，以了解終末宿主在人體包蟲病傳播中所扮演的角色。氣候環境的變化，動物的遷移以及全球化速度加快等因素都可能造成G6—G10基因型的傳播，通過研究中間宿主的生活狀態及遺傳學背景，進一步分析G6—G10基因型在流行病學上的重要性和意義，為包蟲病防控措施的制定提供指導。

由于G6—G10復合群均有感染人的病例，因此其感染途徑與流行不可忽視。通過搜集不同地區不同宿主的樣品，研究其保護性抗原，分析比較不同表達系統生產的重組抗原制成高效新型疫苗，用于控制包蟲病的暴發也十分必要。

目前對G6—G10基因型的深入研究還不充分，它們的定種問題仍存在爭議，其分類學研究仍需要深入進行。因此，應該用多種分子遺傳學標記積累信息，擴充除cox1、nad1等線粒體基因外的其他信息，以獲取更多遺傳變異信息，為分類學研究及分子流行病學的調查提供科學依據和理論指導。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.015

通訊作者：賈萬忠，Email：jiawanzhong@caas.cn

中圖分類號:R383

文獻標識碼：A

文章編號:1002-2694(2016)04-0392-08

Corresponding author:Jia Wan-zhong, Email: jiawanzhong@caas.cn

收稿日期：2015-10-29修回日期：2016-01-25

Genotyping and molecular epidemiology ofEchinococcuscanadensis

LI Shuang-nan1, YAN Hong-bin1, LI Li1, LOU Zhong-zi1, FU Bao-quan1,2,YIN Hong1,2, JIA Wan-zhong1,2

(1.KeyLaboratoryofVeterinaryParasitologyofGansuProvince/KeyLaboratoryofZoonosesofAgricultureMinistry/StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,CAAS,Lanzhou730046,China;2.JiangsuCo-innovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDisease,Yangzhou225009,China)

Abstract:Through aligning the diversity of mitochondrial genome, especially the nad1 and cox1 nucleotide sequences of E. canadensis, recent development studies on genotyping and molecular phylogeny and variation of E. canadensis was summarized. Based on these data, the taxonomic status, nomenclature and evolutionary relationships of E. canadensis genotypes in the genus Echinococcus were determined. Also, advance and future direction of research on E. canadensis were discussed. This review will provide researchers and clinicians in this field with rich molecular epidemiological information or data, and lay theoretical foundation for molecular epidemiological investigations, warning and forecasting, and strategy formulation for comprehensive prevention and control of echinococcosis.

Keywords:Echinococcus canadensis; genotyping; molecular genetic markers; mitochondrial gene; taxonomy; epidemiology

甘肅省科技重大專項(No. 1203NKDA039)、公益性行業農業科研專項(Nos. 200903036-07、201303037、201503-047)、甘肅省科技創新團隊項目(No. 1210RJIA006)和國家肉牛牦牛產業技術體系項目(No. CARS-38)聯合資助