大鼠巨噬細胞感染弓形蟲的基因表達譜分析

趙志軍，董　輝，汪　濤，郭雅琪，鐘　利，王　姝，殷國民，林　茹

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大鼠巨噬細胞感染弓形蟲的基因表達譜分析

趙志軍1,2，董輝1,2，汪濤3，郭雅琪1，鐘利1，王姝1,2，殷國民1，林茹4

1. 寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，銀川750004；2. 寧夏臨床病原微生物重點實驗室，銀川750004；3. 九江學院基礎醫學院病原生物學教研室，九江332000;4. 寧夏醫科大學檢驗學院，銀川750004

摘要：目的分析大鼠腹腔和肺泡巨噬細胞感染弓形蟲RH株的基因表達譜差異。方法以弓形蟲RH株速殖子感染SD大鼠腹腔和肺泡巨噬細胞0 h、6 h后提取細胞總RNA，采用NimbleGen 12x135K微陣列基因表達分析芯片檢測差異表達基因，并對部分表達變化的基因進行Real time PCR驗證。結果表達分析芯片涵蓋大鼠26 419個基因，對差異表達基因(Fold Change≥4.0)進行聚類分析顯示，經弓形蟲RH株作用6 h和0 h 的RNA表達譜相比，大鼠肺泡巨噬細胞上調的基因有49個(主要包括Zfp90，Map4k4，Mrpl42等)，下調的基因有130個(主要包括Pitx1，Chpt1，Chd6等)。大鼠腹腔巨噬細胞上調的基因有136個(主要包括Map2k3，Il17b，Phka2等)，下調的272個(主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等)。GO、Pathway分析差異表達的基因，大鼠腹腔巨噬細胞能夠引發更多和弓形蟲有關的信號通路變化，其肺泡巨噬細胞則不能引起這一效應。Real time PCR和基因芯片檢測結果一致。結論大鼠腹腔和肺泡巨噬細胞感染弓形蟲不同的表現型，可能和其基因表達差異引起的信號通路變化有關。

關鍵詞：大鼠巨噬細胞；弓形蟲；基因表達譜

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弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種嚴格的細胞內寄生原蟲，能感染包括人在內的幾乎所有溫血動物，全世界大約有1/3的人口感染弓形蟲[1]。弓形蟲特殊的生物學特性被認為是研究宿主(或細胞)和寄生蟲相互作用的理想模式生物[2]。大鼠和人類相似，具有抗弓形蟲感染的固有免疫特征，這種特性可能主要是由巨噬細胞介導的。然而，同一宿主不同類型巨噬細胞對弓形蟲感染的固有免疫應答并不一致，這種異質性可能導致肺組織和中樞神經系統對弓形蟲易感[3]。本文將在前期工作的基礎上，通過微陣列基因表達分析芯片研究具有代表性的大鼠腹腔和肺泡巨噬細胞免疫應答反應引起的mRNA表達譜差異變化，以期為揭示弓形蟲病的致病機制和防治提供理論基礎。

1材料與方法

1.1主要實驗材料與試劑弓形蟲RH株由九江學院汪濤副教授惠贈，ICR小鼠、SD大鼠購自寧夏醫科大學動物中心(實驗所用動物都經過寧夏醫科大學倫理委員會批準)；胎牛血清、RPMI 1640、DPBS購自GBICO公司，Trizol試劑購自Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑采用LightCycler○R480 SYBR Green I Master, 5×1 mL包裝。

1.2弓形蟲傳代與純化弓形蟲RH株的傳代采用ICR小鼠腹腔接種。液氮中保存的菌株37 ℃水浴，待復蘇后腹腔注射0.3 mL，6～7 d可見小鼠出現聳毛、反應遲鈍。對有癥狀的小鼠，用手術刀剪開腹部毛皮，露出腹膜，腹腔注射5 mL DPBS，輕輕揉腹部約1 min，抽取腹腔液，注射到正常小鼠，3 d左右即可發病，此時獲取第2代。如此再次接種，直到獲取第3代時，(第3代毒力恢復，蟲株狀態穩定，)將全部腹腔液收回到15 mL離心管。4 ℃，1 300 g離心10 min，收集沉淀，DPBS沖懸，再次離心，RPMI 1640沖懸，細胞計數分析儀進行計數后備用。

1.3腹腔與肺泡巨噬細胞的收集

1.3.1腹腔巨噬細胞的收集用手術刀剪開大鼠腹部毛皮，露出腹膜，腹腔注射15 mL DPBS，輕輕揉腹部約1 min，抽取腹腔液至15 mL離心管。4 ℃，3 500 r/min離心10 min，收集沉淀，DPBS沖懸，再次離心，最后用RPMI 1640沖懸，細胞計數分析儀計數后調整濃度，用于后續試驗。

1.3.2肺泡巨噬細胞的收集將處死的大鼠用手術剪刀剪開頸部皮膚，鈍性分離出包囊器官的肌肉層，然后順著紋理剪開肌肉層，暴露出氣管，在氣管上剪開一個“V”型口，將輸液管的輸液端傾斜剪去輸液部分，小心插入氣管上的“V”型口，小心拔去留置針金屬部分。大鼠用10 mL注射器吸滿8～10 mL DPBS液，緩慢注入肺腔，有阻力時輕輕調整輸液管插入深度，大鼠反復抽吸約5～6次，吸滿50 mL肺泡盥洗液至50 mL離心管中，4 ℃，1 300 g離心10 min，收集沉淀，棄上清，DPBS沖懸，再次離心，最后用RPMI 1640沖懸，細胞計數分析儀進行計數后調整濃度，用于后續試驗。

1.4巨噬細胞細胞培養與純化采用6孔板，每孔加入2 mL細胞溶液，總濃度為5×106個細胞/孔。細胞鋪板后，將培養板放在細胞培養箱中37 ℃，5% CO2培養4 h，然后將上清吸出，并用37 ℃預熱的DPBS輕洗細胞2遍，除去未貼壁的細胞，然后重新加入新鮮的10% 血清的RPMI 1640培養液。

1.5弓形蟲感染實驗弓形蟲與細胞的感染比例為：T.gondii/Cells=1∶1。待巨噬細胞純化培養后，調整純化后的弓形蟲，感染巨噬細胞，使得弓形蟲濃度為4×106個細胞/孔。37 ℃，5% CO2共培養1 h后，吸棄上清，預熱的DPBS輕洗細胞2遍，加入新的10 % 血清的RPMI 1640培養液2 mL，此時定義為感染0 h，在細胞培養箱中37 ℃，5% CO2共培養6 h。分別在0 h，6 h吸棄上清，DPBS輕洗細胞兩遍后收取細胞，加入TRIzol試劑反復吹打后-80 ℃保存。

1.6表達譜芯片以及數據分析RNA提取采用TRIzol試劑，RNA定量采用NanoDrop ND-1000，并進行甲醛變性凝膠電泳檢測完整性。反轉錄采用Invitrogen Superscript ds-cDNA synthesis kit，ds-cDNA標記采用NimbleGen One-Color DNA labeling kit，表達譜芯片采用NimbleGen 12 x 135K Gene Expression Array。Axon GenePix 4000B掃描儀采集芯片圖像，Agilent GeneSpring GX software (version 11.5.1) 軟件進行數據分析。所有樣品通過均一化處理后，選擇RNAs信號強度≥50，重復3次取其平均值，本實驗在上海康成生物有限公司完成。

1.7生物信息學分析對表達譜差異基因基于KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫進行Pathway 分析，Gene Ontology (www.geneontology.org)進行GO分析。

1.8熒光定量PCR試驗驗證隨機選取表達上調和下調因子(NFΚBia、TLR4、TLR2、IL-6、MAP3K8、IL-17b、AKT1、AKT2)，進行引物設計，送上海生工合成。在Roche 480 II熒光定量PCR儀上進行擴增檢測反應。

2結果

2.1RNA的純化及檢測提取的RNA通過甲醛變性瓊脂凝膠電泳檢測結果顯示18S和28S條帶清晰，亮度比約為2∶1。Nanodrop核酸測定儀檢測結果顯示A260/280分別為1.83，1.85，2.00，1.99。提示總RNA純度達到實驗要求無明顯降解。

2.2差異基因表達分析結果采用NimbleGen 12x135K 微陣列基因表達分析芯片，涵蓋大鼠26 419個基因。雜交后的芯片經過掃描、軟件分析及標準化處理后，針對RAMs0h_vs_RAMs6h，RPMs0h_vs_RPMs6h差異表達的RNA(Fold Change≥4.0)，進行聚類分析。數據分析顯示，經過弓形蟲RH株作用6 h后的肺泡巨噬細胞與0 h RNA表達譜相比，上調的RNA有49個，主要包括Zfp90，Map4k4，Mrpl42等。下調的基因有130個，主要包括Pitx1，Chpt1，Chd6等。弓形蟲RH株作用6 h后的腹腔巨噬細胞與0 h RNA表達譜相比，上調的RNA有136個，主要包括Map2k3，Il17b，Phka2等。下調的272個，主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等。

2.3差異表達基因聚類GO分析以P≤0.05作為篩選條件，RAMs6h_vs_RAMs0h_down基因主要的生物學功能是binding(GO:0005488)、protein binding(GO:0005515)、nucleic acid binding(GO:0003676)等，RAMs6h_vs_RAMs0h_up基因主要的生物學功能是binding(GO:0005488)、catalytic activity(GO:0003824)、hydrolase activity(GO:0016787)等，RPMs6h_vs_RPMs0h_down基因主要的生物學功能是NF-kappaB binding(GO:0051059)，polysaccharide binding(GO:0030247)，GTPase activity(GO:0003924)等，RPMs6h_vs_RPMs0h_up基因主要的生物學功能是enzyme regulator activity(GO:0030234)，kinase activity(GO:0016301)，phosphatase activity(GO:0016791)等。

2.4Pathway 結果分析針對RPMs6h_vs_RPMs0h變化顯著的基因，統一指向了弓形蟲引起的共同信號通路(見表1)，RAMs6h_vs_RAMs0h表達差異顯著的基因，經過Pathway分析基因變化引起的信號通路與表1中提示的無關，提示這些信號通路可能在腹腔巨噬細胞抵抗弓形蟲、肺泡巨噬細胞易感弓形蟲中發揮著重要的作用。

表1差異性顯著表達基因KEGG通路分析結果

Tab.1KEGG pathway analysis with differentially expressed genes

KEGG通路分析KEGGpathwayP包含基因數量Genenumber主要基因KeygeneNOD-likereceptorsignalingpathway0.00007216816IL6,BIRC3,CASP1,CCL2,IL18//IL1BToll-likereceptorsignalingpathway0.00054780621TLR2//TLR4//TLR7NF-kappaBsignalingpathway0.00418823718BCL10//BCL2A1D//NFKBIAHIF-1signalingpathway0.01141496015AKT1//AKT2//BCL2MAPKsignalingpathway0.01537111027MAP3//MAP2K3//MAP3KmTORsignalingpathway0.0462888208AKT1//AKT1S1//AKT2TGF-betasignalingpathway0.00279550418ACVR1//ACVR2B//BMP7PI3K-Aktsignalingpathway0.04712266019CCND1//COL27A1//COL2A1Jak-STATsignalingpathway0.04926903010CCND1//CNTFR//CREBBP

2.5熒光定量PCR試驗驗證針對RAMs0h_vs_RAMs6h，RPMs0h_vs_RPMs6h差異表達的RNA(Fold Change≥4.0)隨機選取各自上調因子和下調因子進行Real time PCR驗證，結果基本相符。相對于大鼠RPM0h，RPM6h在NFκB、TLR4、TLR2、IL-6、MAP3K8等呈顯著下調趨勢，而炎性應答因子如IL-17b、AKT1、AKT2等則呈顯著上調趨勢，IL-17表達升高近4.5倍；相對于大鼠RAM0h，RAM6h除了NFκB、MAP3K8呈顯著上調趨勢外，TLR4、TLR2、IL-6、IL-17b、AKT1、AKT2等則呈無明顯變化。

A 大鼠腹腔巨噬細胞感染弓形蟲6 h基因表達譜變化；B大鼠肺泡巨噬細胞感染弓形蟲6 h基因表達譜變化。差異有統計學意義是分別與RPM0h、RAM0h情況比較±s，n=3)A: RPM 6 h VS RPM 0 h; B: RAM 6 h VS RAM 0 h.圖1　Real time PCR對表達譜芯片結果的驗證Fig.1　Verification of the results of the expression profile chip by real time PCR

3討論

大鼠和人感染弓形蟲的特征相似，因此被認為是研究人弓形蟲病的理想模式動物。巨噬細胞對宿主生理功能、免疫調節等具有重要的意義[4]，同時也被認為是機體對抗病原體如弓形蟲等感染最重要防御細胞。由于體外培養的大鼠巨噬細胞能夠抑制弓形蟲增殖，而其他易感宿主細胞卻能支持弓形蟲增殖，因此，巨噬細胞又被認為能夠介導宿主對弓形蟲的抗性[5-7]。

前期工作顯示，弓形蟲能夠在大鼠肺泡巨噬細胞內增殖，而在其腹腔巨噬細胞內則被抑制[8]，這和Catterall等[5]認為同一宿主體內不可能出現對弓形蟲具有不同抗性巨噬細胞的觀點相反，但與Chinchilla等[6]報道弓形蟲能夠在體外培養的大鼠肺泡巨噬細胞內增殖的結論一致。由于肺泡巨噬細胞是宿主抵抗微生物感染的重要防御陣線，人和動物的肺弓形蟲病也常有發生，因此，我們對大鼠巨噬細胞感染弓形蟲不同結局的差異分子機理產生了濃厚的興趣，而腹腔和肺泡巨噬細胞又是宿主體內重要的免疫調節細胞，因此研究大鼠腹腔和肺泡巨噬細胞感染弓形蟲后的基因表達譜差異，對于揭示同一宿主體內不同巨噬細胞弓形蟲感染抗性差異機制具有重要的意義。

實際上，基因表達譜分析及PCR驗證試驗也確實在一定程度上反映了差異機制的存在。弓形蟲RH株感染6 h后的肺泡巨噬細胞相比其0 h表達譜，有49個RNA上調，而腹腔巨噬細胞上調的RNA則有136個，說明腹腔巨噬細胞對弓形蟲存在積極活躍的應答，繼續分析上調基因的特性，肺泡巨噬細胞都主要集中在固有組成型基因(如Zfp90，Mrpl42等)的表達，而腹腔巨噬細胞則表現為包括Map2k3，Il17b，Phka2等激酶及Th1細胞因子的上調表達，在促炎性免疫應答反應過程中抑制了弓形蟲在細胞內的增殖，從而造成腹腔巨噬細胞對弓形蟲特有的抗性。在下調基因表達中，肺泡巨噬細胞仍然沒有腹腔巨噬細胞活躍，只有130個基因表達下調，而腹腔巨噬細胞則有272個，進一步分析下調基因特性仍然顯示肺泡巨噬細胞表達下調的基因和弓形蟲免疫應答相關性不強，而腹腔巨噬細胞則集中在相關信號通路及Tp相關因子主要包括Tlr2，Tgfb2，Wnt2等基因的表達下調。通過以上表達上調和下調的基因分析，我們推測腹腔巨噬細胞可能通過巨噬細胞極化[9]作用發揮了抗弓形蟲的作用，而肺泡巨噬細胞似乎在感染過程中被弓形蟲挾持，造成了“木馬效應”[10]。

在差異表達基因聚類GO分析和Pathway 結果分析中，我們可以明確看到RPMs6h對RPMs0h變化顯著的基因，和弓形蟲引起的共同信號通路(見表1)有關，如RPMs6h對RPMs0h_up中enzyme regulator activity(GO:0030234)，kinase activity(GO:0016301)，phosphatase activity(GO:0016791)等基因的表達上調，能夠很好的解釋腹腔巨噬細胞抗弓形蟲感染的特性。而RAMs6h對 RAMs0h變化顯著的基因并無此相關通路，這和我們認為腹腔和肺泡巨噬細胞通過Th1/Tp免疫平衡進而影響巨噬細胞極化造成對弓形蟲的抗性預測不同，肺泡巨噬細胞對弓形蟲的感染免疫應答似乎存在其他的機制。另外Pathway結果將RPMs6h對RPMs0h變化顯著的基因，統一指向了弓形蟲誘導的共同信號通路(見表1)，而RAMs6h對RAMs0h變化顯著的基因并無此相關通路，肺泡巨噬細胞易感弓形蟲的分子機制，除了可能和上述“木馬效應”有關外，也可能和其靜息狀態有關[11-12]。

綜上，通過基因表達譜分析及其驗證試驗，我們發現大鼠腹腔巨噬細胞抑制弓形蟲在其細胞內增殖的分子機制，主要是通過上調和Th1有關的因子和降低Tp有關因子，相關信號通路都指向了弓形蟲誘導的共同的信號通路，而肺泡巨噬細胞對弓形蟲的抗性雖已明確，但通過表達譜分析我們并未發現有規律的基因表達變化，提示我們尚需擴大樣本量研究或改變研究策略以獲得其可能的感染機制。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.011

通訊作者：董輝，Email：173401951@qq.com

中圖分類號：R382.5

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0371-05

Corresponding author:Dong Hui，Email:173401951@qq.com

收稿日期：2015-09-17修回日期：2015-12-17

Gene expression profile analysis of the rat macrophages infected withToxoplasmagondii

ZHAO Zhi-jun1,2, DONG Hui1,2, WANG Tao3, GUO Ya-qi1,ZHONG Li1,2, WANG Shu1,2, YIN Guo-min1, LIN Ru4

(1.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.NingxiaKeyLaboratoryofClinicalandPathogenicMicrobiology,Yinchuan750004,China;3.DepartmentofPathogenicBiology,MedicalCollege,JiujiangUniversity,Jiujiang33200,China;4.DepartmentofInspectionCollege,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Abstract:Since rat macrophages are very important for the resistance of Toxoplasma gondii infection, we investigated the differential expression profiling between rat peritoneal and alveolar macrophages by using NimbleGen 12x135K microarray in this study. Through clustering analysis (Fold Change≥4.0), the results showed that there were 49 high expression genes (mainly including Zfp90, Map4k4, Mrpl42 and so on) and 130 low expression genes (mainly including Pitx1, Chpt1, Chd6 and so on) in rat alveolar macrophages at the time course of T.Gondii RH strain infection 0 h and 6 h. As for rat peritoneal macrophages at this condition, there were 136 high expression genes (mainly including Map2k3, Il17b, Phka2 and so on) and 272 low expression genes(mainly including Tlr2, Tgfb2, Wnt2 and so on). Further analysis by Go and Pathway methods revealed that rat peritoneal macrophages could trigger more reaction on the related pathway about toxoplamosis, otherwise the alveolar macrophages could not. The results were verified by real-time PCR and the result of verification were entirely coincident. Therefore, the results indicated that the different phenotype between rat alveolar and peritoneal macrophages infected with T. Gondii RH strain may be related to their different expression gene which was connected to toxoplasmosis reaction.

Keywords:rat macrophaes; alveolar; peritoneal; gene expression profile

寧夏自然科學基金(No.NZ1245)，寧夏教育廳項目(2013)以及國家自然科學基金青年科學基金(No.81301945)聯合資助