幾類主要病原需氧放線菌菌屬的SecA1基因分析研究

牟麗麗，涂云華，明春艷，夏茂寧，孟俞辰，康穎倩

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幾類主要病原需氧放線菌菌屬的SecA1基因分析研究

牟麗麗1，涂云華2，明春艷1，夏茂寧1，孟俞辰1，康穎倩1

1.貴州醫(yī)科大學微生物學教研室，貴陽550004;2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院皮膚性病專科，貴州550004

摘要：目的了解幾類主要病原需氧放線菌不同菌屬間SecA1基因堿基突變特點，為病原需氧放線菌的實驗室診斷，分類及致病性提供一定的實驗室理論數(shù)據(jù)。方法以162株需氧放線菌為實驗研究對象，通過分子生物學方法對需氧放線菌SecA1基因擴增測序，及收集NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的需氧放線菌SecA1基因，運用多序列對比及DNAStar軟件對需氧放線菌SecA1序列進行特異性基序分析及SecA1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和表位特性預測。結(jié)果需氧放線菌不同菌屬間SecA1序列在300～350 bp區(qū)域有著特異性差異，經(jīng)預測該區(qū)域編碼的SecA1蛋白二級結(jié)構(gòu)屬間大致相同，而蛋白質(zhì)柔性區(qū)域、親水性及表面可及性等性質(zhì)在屬間存在差異，其中以Mycobacteria菌屬的差異較為明顯。結(jié)論需氧放線菌SecA1基因不同菌屬間具有特異性的堿基突變，這種突變導致屬間SecA1蛋白部分性質(zhì)有差異，與各菌屬致病性可能存在著一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：需氧放線菌；SecA1基因；堿基突變；SecA1 蛋白

Supported by the National Natural Science Fund of China (Nos. 31060006 & 31260029), the Social Development Research Project of Guizhou (No.[2011] 3017), and the Social Development & Livelihood Plan of Guiyang (No.[2011103]16)

需氧放線菌(aerobic actinomycetes)是一群專性需氧，革蘭氏染色陽性，呈絲狀分支，生長速度相對較緩慢的一類微生物。放線菌廣泛存在于世界各地富含腐生物質(zhì)的土壤中和其它自然環(huán)境中。然而，大量增加的臨床病例證實有部分放線菌是導致人類疾病的誘因，尤其導致一些機體嚴重的免疫系統(tǒng)障礙[1-3]。病原需氧放線菌如Nocardia屬的菌株可引起免疫缺陷或非免疫缺陷的宿主疾病[4-6]，其中對人或動物致病的主要有星形諾卡氏菌(Nocardiaasteroides)和巴西諾卡氏菌(Nocardiatransvalensis)，星形諾卡氏菌是需氧放線菌中最常見的動物病原體，最常見的動物疾病為牛乳腺炎[7-8]，也曾被報道引起魚類感染[9-10]；其他可引起人獸共患病的病原需氧放線菌如Mycobacteria菌屬的牛型分支桿菌(Mycobacteriumbovis)為牛的致病菌，可引起牛的結(jié)核感染，而人由于食入未經(jīng)消毒或已污染此菌的牛乳也可被感染[11]。

在需氧放線菌等原核生物的系統(tǒng)發(fā)育分析及分類地位的確定中，16S rRNA 基因作為一種理想的研究材料而被廣泛應用。然而隨著研究的深入，16S rRNA 基因也表現(xiàn)出了不容忽視的缺點：高保守性使其不能很好的區(qū)分屬內(nèi)不同的物種；在基因組內(nèi)的多拷貝性使確定其序列的準確性降低[12]。為彌補16S rRNA基因的缺點，人們開始嘗試使用其他不同的看家基因(gyrB、recA基因等) 進行放線菌的分子生物學分析。 Fischer[13]擴增了分枝桿菌屬29個種的47株ATCC標準菌和59株臨床分離菌的SecA1基因序列，首次發(fā)現(xiàn)分泌相關(guān)基因可以用于區(qū)分分枝桿菌屬內(nèi)的不同菌種。Conville等[14]分析比較了諾卡氏菌屬的29個種的16S rRNA以及SecA1基因序列，發(fā)現(xiàn)SecA1基因能更好更準確地區(qū)分和鑒別諾卡氏菌屬內(nèi)的菌種。本課題組在前期研究中[15]在對戈登氏屬的23個模式種分別進行了SecA1基因和16S rRNA系統(tǒng)進化關(guān)系的比較發(fā)現(xiàn)，SecA1作為看家基因用來進行種水平的鑒定以系統(tǒng)進化的研究，是非常理想的靶標。本研究在分析比較幾類主要病原需氧放線菌菌屬SecA1基因過程中，發(fā)現(xiàn)SecA1基因300～350 bp區(qū)域在不同菌屬間的基因突變各具其特點。

1材料與方法

1.1菌株來源用于實驗分析的菌株共162株，其中實驗測序的菌株30株(日本千葉大學真菌醫(yī)學研究所贈予)，包括Nocardia屬12株、Gordonia屬18株；在NCBI(The National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫中收集含SecA1基因的不同種屬的需氧放線菌132株，分別包括Gordonia菌34株、Mycobacteria菌48株、Nocardia菌35株、Tsukamurella菌7株、Rhodococcus菌7株、Streptomyces菌1株。1株Streptomyces菌為白黃鏈霉菌分離自澳大利亞紅樹植物組織[8]，為環(huán)境中分離的需氧放線菌，作為對照株，其余菌株為病原需氧放線菌。

1.2培養(yǎng)基和試劑高氏一號固體培養(yǎng)基(Difco Laboratories)，CTAB(四川金山制藥公司)，PCR試劑盒(Fermentas公司)，Taq-DNA多聚酶(上海英俊)1.3需氧放線菌DNA提取及SecA1基因擴增根據(jù)文獻[16]的方法提取需氧放線菌DNA，細菌SecA1基因擴增通用引物SecA1-f: 5′-GTAAAACGACGGCCAGGACAGYGAGTGGATGGG YCGSGT GCACCG-3′，SecA1-r: 5′-CAGGAAACAGCTATGACGCGGACGATGTAGTCC TTGTC-3′分別為前后引物(上海英俊生物技術(shù)有限公司合成)。以SecA1-f、SecA1-r為引物，用PCR試劑盒在26 μL 反應體系中擴增，上、下游引物及DNA各1 μL，反應條件為預變性94 ℃ 4 min，然后變性94 ℃ 30 s、 退火 58 ℃ 50 s、 延伸72 ℃ 1 min 循環(huán)35次，最后72 ℃ 延伸10 min，將產(chǎn)物于1.0% 瓊脂糖中電泳后在紫外燈下觀察，并將擴增產(chǎn)物進行測序。

1.4SecA1基因序列分析收集NCBI數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的不同種屬氧放線菌的SecA1基因，分別包括Gordonia菌屬、Mycobacteria菌屬、Nocardia菌屬、Tsukamurella菌屬、Rhodococcus菌屬、Streptomyces菌屬的SecA1基因。

將本研究中擴增的SecA1基因測序序列及NCBI數(shù)據(jù)庫中收集的SecA1基因序列在DNAMAN中進行多序列對比，分析各菌屬間特異的堿基基序。

1.5不同菌屬間特異性堿基區(qū)域?qū)陌被嵝蛄蟹治鰧ecA1基因?qū)陌被嵝蛄性贒NAMAN中進行多序列對比，分析不同菌屬間特異性堿基區(qū)域?qū)陌被嵝蛄械淖兓?/p>

采用DNAStar軟件的Protean模塊對不同菌屬間特定區(qū)域的SecA1蛋白進行預測。分別以Garnier-Robson法預測其二級結(jié)構(gòu)，以Karplus-Schulz法預測其柔性區(qū)域。以Kyte-Doolittle方法進行親水性區(qū)域分析，以Emini方案進行氨基酸位于分子表面可能性分析，以Jameson-Wolf法進行抗原指數(shù)分析。

2結(jié)果

2.1不同需氧放線菌菌屬間SecA1序列分析經(jīng)過DNAMAN多序列對比后發(fā)現(xiàn)，堿基序列在300～350 bp區(qū)域存在堿基的突變，且不同需氧放線菌菌屬間有著特異性差異。本研究選擇各菌屬的標準菌株的SecA1堿基序列作為其菌屬代表序列，且各菌屬的代表序列與同屬的序列有著80%相似率。

幾類病原放線菌菌屬間在SecA1基因300～350 bp區(qū)域，屬間特異性堿基區(qū)域比對結(jié)果見表1，在300～350 bp基因區(qū)域，共有24處堿基突變，其中顛換頻率為54.2%，轉(zhuǎn)換頻率為46.8%。(見表2)

表1不同需氧放線菌菌屬SecA1基因特異性堿基位點

Tab.1SecA1 gene specific motifs among different genera of aerobic actinomycetes

放線菌菌屬Actinomycesgenus300bp310bp320bp330bp340bp

表2需氧放線菌菌屬的SecA1基因突變情況

Tab.2SecA1 gene specific motifs mutation features among different genera of aerobic actinomycetes

堿基突變位點Basemutationsites堿基突變類型Basemutationtypes305,311,335,338,344,C—A(顛換)C—A(basetransversion)307,319,331,337,340,346,349G—C(顛換)G—C(basetransversion)313G—T(顛換)G—T(basetransversion)302,316,318,322C—T(轉(zhuǎn)換)C—T(basetransition)308,310,312,313,339,345,350G—A(轉(zhuǎn)換)G—A(basetransition)

2.2特異性堿基區(qū)域?qū)陌被嵝蛄斜葘Σ≡啪€菌菌屬間特異性堿基區(qū)域?qū)陌被嵝蛄幸舶l(fā)生了變化，不同菌屬氨基酸序列在100～120 bp共有11處變異，見表3。在100位處，Mycobacteria菌屬及Tsukamurella菌屬的氨基酸為M(甲硫氨酸)，其余菌屬為L(亮氨酸)；101位：Gordonia菌屬、Mycobacteria菌屬及Tsukamurella菌屬為E(谷氨酸)，其余為K(賴氨酸)；102位：Gordonia菌屬為R(精氨酸)、Rhodococcus菌屬為P(脯氨酸)、其余為K(賴氨酸)；103位：Rhodococcus菌屬為E(谷氨酸)，其余為D(天冬氨酸)；104位：Mycobacteria菌屬為T(蘇氨酸)、Nocardia菌屬為L(亮氨酸)，其余為V(纈氨酸)；108位：Rhodococcus菌屬為I(異亮氨酸)，其余為V(纈氨酸)；110位：Mycobacteria菌屬為L(亮氨酸)，其余為I(異亮氨酸);111位：Gordonia菌屬、Nocardia菌屬及Streptomyces菌屬為K(賴氨酸)，其余為R(精氨酸)；113位：Gordonia菌屬及Tsukamurella菌屬為K(賴氨酸)，其余為R(精氨酸)；115位：Mycobacteria菌屬及Rhodococcus菌屬為V(纈氨酸)，其余為I(異亮氨酸)；118位：Tsukamurella菌屬為N(天冬酰胺)，其余為H(組氨酸)。

表3不同需氧放線菌菌屬特異性氨基酸基序

Tab.3Amino acids specific motifs mutation features among different genera of aerobic actinomycetes

放線菌菌屬Actinomycesgenus100bp110bp120bp

(1)Gordonia菌屬

(2)Mycobacteria菌屬

(3)Nocardia菌屬

(4)Rhodococcus菌屬

(5)Tsukamurella菌屬

(6)Streptomyces菌屬圖1　氨基酸序列DNAStar分析結(jié)果Fig.1　Analysis of the amino acids by DNAStar

3討論

放線菌廣泛分布于自然界中，是微生物中與人的關(guān)系非常密切而大有應用前途的一類菌。在我國已有不少科學家對于土壤和極端環(huán)境中的放線菌研究比較深入[17-19]。需氧放線菌(aerobic actinomycetes)是一群專性需氧，革蘭氏染色陽性，呈絲狀分支，生長速度相對較緩慢的一類微生物。在過去它們曾被誤認為屬于真菌類。廣泛存在于世界各地富含腐生物質(zhì)的土壤中和其它自然環(huán)境中。1888年,法國科學家Edmond Nocard首次分離出這類潛在的致病微生物，需氧放線菌能生產(chǎn)新型抗菌制劑，同時也是一類能感染人及動物的潛在病原菌[20]，往往通過呼吸了污染的粉塵微粒或表面?zhèn)诘那治g而引起一些肺部或皮膚等典型感染。大量增加的臨床病例證實病原需氧放線菌是導致人類疾病的誘因，尤其導致一些機體嚴重的免疫系統(tǒng)障礙。如移植患者或艾滋病毒感染患者，且這類微生物感染的抗菌療法可并發(fā)耐藥性。與醫(yī)學相關(guān)的重要需氧放線菌如諾卡氏菌屬Nocardia是與人類疾病相關(guān)的常見放線菌之一。肺部諾卡氏菌感染是在發(fā)展中國家中人類諾卡氏菌感染中最為常見的一類疾病，引起肺部急性，亞急性的化膿壞死性感染。其中對人致病的主要是外源性感染星形諾卡氏菌，其次是巴西諾卡氏菌。足菌腫(Mycetoma)和孢子絲菌病(sporotrichoid infection)在熱帶或亞熱帶地區(qū)(如南非，中非，南美洲，美國南部區(qū)域等)比較普遍，其病原菌主要是Nocardiabrasiliensis，也可由其它諾卡氏菌種引起。播散性諾卡氏菌病可由肺部或皮膚向中樞神經(jīng)系統(tǒng)，骨骼關(guān)節(jié)，眼部，心肝脾腎胰等部位擴散。紅球菌屬Rhodococcus是可以引起皮膚感染，肺部感染，菌血癥，眼內(nèi)炎，腹膜炎，前列腺膿腫及靜脈置管后敗血癥的罕見菌屬。此外，分支桿菌屬Mycobacteria中的結(jié)核分支桿菌Mycobacteriumtuberculosis和麻風分支桿菌Mycobacteriumleprae引起的嚴重病癥也眾所周知。

在臨床上除非是已經(jīng)懷疑有相應感染可能性，需氧放線菌通常會被漏診或誤診[20]。對臨床病原需氧放線菌分離的了解有助于內(nèi)科大夫診斷疾病和設(shè)計合理正確的用藥治療方案。SecA1等類似的看家基因，在放線菌系統(tǒng)發(fā)育分析和分子進化領(lǐng)域里, 發(fā)揮了其高分辨率的優(yōu)勢。Sec系統(tǒng)是相當保守的分泌機制，在古菌、細菌及真核生物中都存在。Sec分泌途徑在細菌中，尤其是大腸桿菌已得到了廣泛的研究[21]。由SecA1基因編碼的SecA1蛋白具 ATPase活性，作為前體蛋白轉(zhuǎn)位酶(Protein translocase)的重要成分，為蛋白的跨質(zhì)膜輸送提供驅(qū)動力。前體蛋白移位酶被認為是一個高度動態(tài)的納米機器[22]，通過它的多聚合體結(jié)構(gòu)可向前移動，位于中心的SecAATPase位移提供能量。

本研究將SecA1基因多序列對比后發(fā)現(xiàn)，堿基序列在300～350 bp區(qū)域存在堿基的突變，且不同需氧放線菌菌屬間有著特異性差異。各菌屬間堿基有24處不同，氨基酸有11處不同，這種變異導致其編碼的蛋白質(zhì)在100～120位點間的部分性質(zhì)在各菌屬間并不相同，差異以Mycobacteria菌屬較為突出。Streptomyces菌作為環(huán)境分離的菌株(對照)與Nocardia屬、Gordonia屬及Rhodococcus屬的蛋白性質(zhì)大致相同，而Tsukamurella菌屬的蛋白質(zhì)柔性區(qū)域增加一個區(qū)域，提示該區(qū)域容易發(fā)生構(gòu)象變化[23]；Mycobacteria菌屬的蛋白質(zhì)親水性、抗原指數(shù)及表面可及性較其余菌屬增強，提示該菌屬暴露在蛋白質(zhì)表面的親水基更容易和其他蛋白質(zhì)分子結(jié)合[24]。Mycobacteria菌屬特異的性質(zhì)可能與該菌屬致病性有關(guān)。本研究采用DNAStar軟件的Protean模塊對不同菌屬間特定區(qū)域的SecA1蛋白進行預測，具體機制還需進一步試驗證實。

對于其它一些常見的代表病原需氧放線菌屬，如Actinomadurae菌屬、Thermoactinomyces菌屬、Saccharomonospora相關(guān)各屬等，尚未對其SecA1基因進行擴增測序分析，GenBank中也未發(fā)現(xiàn)儲存的相應基因序列信息。因此為了擴大本研究中需氧放線菌屬間SecA1基因分析研究，我們后期試驗將對這些放線菌屬的菌株進行SecA1基因補充擴增測序。本研究對不同菌屬需氧放線菌進行SecA1基因多序列分析，分析結(jié)果為病原需氧放線菌的臨床分類、診斷及致病性提供一定的實驗室理論數(shù)據(jù)。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.007

通訊作者：康穎倩，Email: joycekangtokyo@qq.com

中圖分類號：R379.1

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0349-07

Corresponding author:Kang Ying-qian, Email: joycekangtokyo@qq.com

收稿日期：2015-10-26修回日期：2015-12-25

SecA1 gene sequences for aerobic actinomycetes

MU Li-li1, TU Yun-hua2, MING Chun-yan1,XIA Mao-ning1,MENG Yu-chen1,KANG Ying-qian1

(1.DepartmentofMicrobiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;2.DepartmentofDermatologyandVenerealDisease,theAffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guizhou550004,China)

Abstract：We analyzed the SecA1 gene mutation features among different genera of aerobic pathogenic actinomycetes and provided some basic theoretical datum for the clinical diagnosis, classification and pathogenicity of aerobic actinomycetes. One hundred and sixty-two aerobic actinomycetes strains were used in this study. The SecA1 gene sequences of aerobic actinomycetes were amplified by the laboratory or collected in the NCBI database. The gene specific motifs and the SecA1 protein secondary structure were analyzed by multiple sequence alignment and DNAStar. Results showed that each genus had a specific area in SecA1 gene (300～350 bp). The hydrophilicity plot and surface probability of the SecA1 protein properties were various among different genera, and those above characteristics of Mycobacteria were obviously different from other studied genera. In conclusion, the specific SecA1 gene nucleotide mutations exist in each pathogenic actinobacterial genus, which can cause the differences of SecA1 protein properties, which may correlated with the pathogenic characteristics of relevant genera.

Keywords:aerobic actinomycetes; SecA1 gene; nucleotide mutation; SecA1 protein

國家自然基金地方項目(No.31060006，No.31260029)，貴州省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目([2011]3017號)和貴陽市科技局社會發(fā)展與民生計劃([2011103]16號)聯(lián)合資助