肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁鈣化相關(guān)受體

張旭勇，楊　濤，王思博，夏　杰，郭　軍，印雙紅，陳雪玲，吳向未

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肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁鈣化相關(guān)受體

張旭勇1，楊濤1，王思博1，夏杰1，郭軍1，印雙紅2，陳雪玲3，吳向未1

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，石河子832000；2.銅仁學(xué)院護(hù)理學(xué)院，銅仁554300；3.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，石河子832002

摘要：目的比較肝細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁及非鈣化外囊壁上的鈣化相關(guān)受體BMPRⅡ(骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體)、IGF1R(胰島素樣生長因子1受體)和ERα(雌激素受體α)的表達(dá)差異。方法鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁茜素紅染色，Envision免疫組化法和qRT-PCR分別檢測同一細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁及非鈣化外囊壁上鈣化相關(guān)受體BMPRⅡ、IGF1R和ERα的表達(dá)水平和鈣化相關(guān)受體的mRNA表達(dá)量。結(jié)果與細(xì)粒棘球蚴非鈣化外囊壁相比較，同一患者鈣化外囊壁茜素紅染色鈣化顯著，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.369，P<0.01)；鈣化外囊壁相關(guān)受體的表達(dá)明顯增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，mRNA表達(dá)量明顯增高且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論肝細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁鈣化相關(guān)受體表達(dá)量較高，鈣化相關(guān)因子通過與受體BMPRⅡ、IGF1R和ERα等結(jié)合，引起細(xì)粒棘球蚴外囊壁鈣化，外囊壁的鈣化可以有效地抑制細(xì)粒棘球蚴的生長，在細(xì)粒棘球蚴病患者臨床治療過程中發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：肝細(xì)粒棘球蚴??；鈣化外囊；骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體；胰島素樣生長因子1受體；雌激素受體α

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細(xì)粒棘球蚴病(包蟲病)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病[1-2]，多發(fā)于肝臟，呈世界性分布，新疆是高發(fā)區(qū)，肝囊型包蟲病(Hepatic cystic echinococcosis)是包蟲病的常見類型。在肝細(xì)粒棘球蚴病內(nèi)層纖維囊壁膨脹性形成過程中,囊周Glisson系統(tǒng)和肝靜脈系統(tǒng)受擠壓并不斷纖維化,形成另一層纖維囊壁(外囊壁)[3],肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁中的主要細(xì)胞組成為成纖維樣細(xì)胞，由胚胎時期的間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來，和成骨細(xì)胞相似，存在著類似的骨誘導(dǎo)表現(xiàn)，骨誘導(dǎo)的定義最初由Urist[4]提出:在一種可彌散的特定的因子作用下,間充質(zhì)細(xì)胞聚集并向軟骨以及骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程即稱為骨誘導(dǎo)，具備誘導(dǎo)活性的因子有許多,比如BMPs(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)、IGF1(胰島素樣生長因子1)和雌激素，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞方向分化。鑒定肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁細(xì)胞鈣化相關(guān)受體BMPRⅡ、IGF1R和ERα，進(jìn)一步研究外囊壁細(xì)胞的鈣化體外模型，進(jìn)行抗蟲藥物的篩選，誘導(dǎo)肝包蟲外囊壁鈣化，可能成為現(xiàn)有治療學(xué)上的重要補充，為包蟲病的治療提供新的策略。故鈣化相關(guān)受體的表達(dá)鑒定分析具有一定的價值。本課題研究小組通過茜素紅染色、免疫組織化學(xué)方法和qRT-PCR對BMPRⅡIGF1R和ERα的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象及臨床標(biāo)本的選擇以石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科臨床手術(shù)取出的肝細(xì)粒棘球蚴病患者的鈣化外囊壁為研究對象，同一患者的非鈣化外囊壁為對照組。肝細(xì)粒棘球蚴病患者術(shù)前經(jīng)B超和CT檢查，外囊壁存在部分鈣化，密度增強。本研究通過院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號LL20111223001)，取材前經(jīng)得患者同意并均已簽署知情同意書。

1.1.2臨床資料收集肝膽外科住院手術(shù)病人2012年2月～2015年5月肝細(xì)粒棘球蚴病手術(shù)患者45例，男27例，女18例，年齡在32～63歲，平均46.8±11.4歲，病程3～12年。

1.1.3主要試劑茜素紅染料(Cyagen Biosciences美國)，兔抗人BMPRⅡ(abcam英國)、兔抗人IGF1R(abcam英國)、兔抗人ERα抗體(abcam英國)，二抗(Dako丹麥)及DAB試劑盒(Dako丹麥)。RNA提取試劑盒(QIAGEN德國)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo美國)、OneStep RT-PCR Kit(QIAGEN德國)。BMPRⅡ、IGF1R、ERα及內(nèi)參引物，根據(jù)Gen Bank中人BMPRⅡ、IGF1R、ERα及內(nèi)參β-Actin的基因序列，應(yīng)用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行比較分析，選擇合適的區(qū)域合成引物，有上海生工公司合成，見表1。

表1　RT-PCR引物序列表

1.2方法

1.2.1組織病理學(xué)檢查取材于液氮罐中和術(shù)中標(biāo)本，取材后置于10%中性福爾馬林溶液中，48 h后常規(guī)脫水、包埋、切片4 μm，茜素紅染色和免疫組化染色，診斷。qRT-PCR取材后用試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，定量 PCR檢測分析。

1.2.2茜素紅染色4 μm切片經(jīng)過二甲苯及梯度酒精脫蠟脫水，茜素紅染色10 min，PBS沖洗掉染料，脫水封片，觀察結(jié)果，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。Envision二步法檢測對照組和實驗組中BMPRⅡ、IGF1R和ERα的表達(dá)。4 μm切片經(jīng)過二甲苯及梯度酒精脫蠟脫水，pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液中高溫修復(fù)8 min，自然冷卻到室溫(25 ℃)后3%過氧化氫室溫孵育10 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性(無血清阻斷)，滴加一抗(BMPRⅡ、IGF1R和ERα濃度均是1∶100)后4 ℃冰箱過夜，PBS 3×5 min浸洗后滴加二抗,37 ℃恒溫箱放置30 min后PBS 3×5 min浸洗，DAB染色2～5 min(根據(jù)顯微鏡下觀察顯色結(jié)果適時終止染色)，蘇木素復(fù)染、酸化、脫水、封片。顯微鏡下觀察結(jié)果，統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。實時熒光定量PCR檢測BMPRⅡ、IGF1R和ERα mRNA的表達(dá)量。按照Trizol說明提取外囊壁總RNA，取5 μL提取的RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成20 μL的cDNA，在進(jìn)行實時熒光定量PCR。反應(yīng)體系：cDNA 3 μL,SYBR GreenⅠ12.5 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，無酶水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s， BMPRⅡ、IGF1R、ERα和β-Actin 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.2.3陽性結(jié)果判定及標(biāo)準(zhǔn)茜素紅染色：染色強度分為：未見鈣鹽沉積(-)0分、點狀鈣鹽沉積(+)1分、彌漫鈣鹽沉積(2+)2分；染色陽性范圍分為：≤50%為0分、50%～75%為1分、≥75%為2分；兩項得分相乘≥2分為陽性。免疫組織化學(xué)染色：著色強度分為：無色(-)0分、淺黃色(+)1分、黃色及更深顏色(2+)2分；陽性細(xì)胞數(shù)分級為：≤50%為0分、50%～75%為1分、≥75%為2分；兩項得分相乘≥2分為陽性。

2結(jié)果

2.1茜素紅染色結(jié)果茜素紅與鈣離子以螯合的方式形成復(fù)合物,用來識別組織細(xì)胞的鈣鹽成分，通過茜素紅染色,產(chǎn)生紅色沉積(即鈣結(jié)節(jié))，細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁中茜素紅染色鈣鹽沉積情況(表2)。兩者的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.369，P<0.01)，提示鈣鹽在肝細(xì)粒棘球蚴病鈣化外囊壁中的沉積水平顯著升高：其中鈣化外囊壁組陽性率為77.78%(35/45)，非鈣化外囊壁組陽性率為31.11%(14/45)，兩組經(jīng)四格表檢驗，χ2=20.369，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2　鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁茜素紅染色情況

2.2肝細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁中BMPRⅡ、IGF1R和ERα的表達(dá)情況(見表3，圖1-3)肝細(xì)粒棘球蚴病患者鈣化外囊壁細(xì)胞中這些鈣化相關(guān)受體的表達(dá)水平顯著升高，比較實驗組與對照組兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中受體BMPRⅡ在實驗組陽性率為67.44%(29/43 注：脫片2張)，對照組陽性率為27.50%(11/40)，兩組經(jīng)卡方檢驗，χ2=14.960，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3　鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁中BMPRⅡ、IGF1R和ERα的表達(dá)情況

2.3實時熒光定量PCR檢測肝細(xì)粒棘球蚴患者鈣化外囊壁細(xì)胞和非鈣化外囊壁細(xì)胞BMPRⅡ、IGF1R和ERαmRNA的表達(dá)量PCR檢測結(jié)果如圖4顯示：這些鈣化相關(guān)受體的mRNA的表達(dá)量升高，實驗組與對照組兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

a.非鈣化外囊壁茜素紅染色；b.鈣化外囊壁茜素紅染色；c.非鈣化外囊壁BMPRⅡ表達(dá)較弱；d. 鈣化外囊壁BMPRⅡ表達(dá)較強。a. Alizarin Red staining in non-calcified hydatid pericyst wall; b. Alizarin Red staining in calcified hydatid pericyst wall; c. BMPRⅡin non-calcified hydatid pericyst wall; d. BMPRⅡexpressed higher in calcified hydatid pericyst wall.圖1　非鈣化外囊壁和鈣化外囊壁中茜素紅染色、BMPRⅡ的表達(dá)Fig.1　Alizarin Red staining and the expression of BMPRⅡin non-calcified hydatid pericyst wall and calcified hydatid pericyst wall(200×)

a.非鈣化外囊壁茜素紅染色；b.鈣化外囊壁茜素紅染色；c.非鈣化外囊壁IGF1R表達(dá)較弱；d. 鈣化外囊壁IGF1R表達(dá)較強。a.Alizarin Red staining in non-calcified hydatid pericyst wall; b. Alizarin Red staining in calcified hydatid pericyst wall; c. IGF1R in non-calcified hydatid pericyst wall; d. IGF1R expressed higher in calcified hydatid pericyst wall.圖2　非鈣化外囊壁和鈣化外囊壁中茜素紅染色、IGF1R的表達(dá)Fig.2　Alizarin Red staining and the expression of IGF1R in non-calcified hydatid pericyst wall and calcified hydatid pericyst wall(200×)

a.非鈣化外囊壁茜素紅染色；b.鈣化外囊壁茜素紅染色；c.非鈣化外囊壁ERα表達(dá)較弱；d. 鈣化外囊壁ERα表達(dá)較強。a. Alizarin Red staining in non-calcified hydatid pericyst wall; b. Alizarin Red staining in calcified hydatid pericyst wall; c.ERα in non-calcified hydatid pericyst wall. d. ERα expressed higher in calcified hydatid pericyst wall.圖3　非鈣化外囊壁和鈣化外囊壁中茜素紅染色、ERα的表達(dá)Fig.3　Alizarin Red staining and the expression of ERα in non-calcified hydatid pericyst wall and calcified hydatid pericyst wall(200×)

*P<0.05圖4　非鈣化外囊壁和鈣化外囊壁鈣化相關(guān)受體mRNA的表達(dá)水平Fig.4　Percent of calcium related receptor mRNA of non-calcified hydatid pericyst wall and calcified hydatid pericyst wall vs. control group

3討論

作為肝細(xì)粒棘球蚴宿主的免疫防御反應(yīng)的結(jié)果，外囊壁的形成，借以局限細(xì)粒棘球蚴囊腫的病程進(jìn)展[5]。雖然外囊壁鈣化不能完全等同于蟲體死亡，但其往往提示著細(xì)粒棘球蚴生物學(xué)上失去活性，臨床上處于靜止期，理由是外囊壁鈣化可以有效地控制寄生蟲的營養(yǎng)攝取[6]。國內(nèi)彭新宇、吳向未等[7-8]與其他實驗室研究人員發(fā)現(xiàn)：在肝細(xì)粒棘球蚴病周圍纖維囊壁鈣化處富含骨蛋白如，包括骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、 基質(zhì)小泡及成骨/軟骨樣細(xì)胞等[9]，成纖維細(xì)胞像成骨細(xì)胞一樣產(chǎn)生基質(zhì)小泡并引起小泡內(nèi)的鈣鹽沉積，提示骨形成機制可能在肝包蟲周圍纖維囊壁鈣化的形成中起重要作用[10-11]。本實驗利用BMPRⅡ、IGF1R和ERα在調(diào)控組織細(xì)胞鈣化上的重要作用，研究鈣化外囊壁與非鈣化外囊壁上的BMPRⅡ、IGF1R和ERα受體的差異情況，加強細(xì)胞因子與這些受體的結(jié)合，有望誘發(fā)、加強肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁細(xì)胞的鈣化，成為肝細(xì)粒棘球蚴病治療學(xué)的新靶點。

外囊壁鈣化相關(guān)受體BMPRⅡ、IGF1R和ERα等在肝細(xì)粒棘球蚴外囊鈣化過程中有著重要的作用,BMPs是一組具有很強骨誘導(dǎo)活性的生長因子,可能是誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞系轉(zhuǎn)化的基本信號因子,其中BMP2是目前已知的具有最強異位成骨能力的細(xì)胞因子，能夠使未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞，并誘導(dǎo)形成骨組織[12]。BMPs與細(xì)胞膜上的BMPRⅡ結(jié)合，通過 Smads 蛋白傳遞分化信號，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[13]。近期相關(guān)研究顯示，IGF1對BMP2之間可能存在協(xié)同成骨作用[14-15]，IGF1可增強BMP2介導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。Schmidmaier等[16]將胰島素樣生長因子Ⅰ和 BMP-2 聯(lián)合用于大鼠的股骨骨折愈合實驗，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合應(yīng)用對于骨折愈合，在生物力學(xué)和組織學(xué)上效果都更為明顯，同時并發(fā)癥也降低。BMPRⅡ、IGF1R受體和mRNA表達(dá)量在鈣化外囊壁中的表達(dá)明顯高于非鈣化外囊壁中的表達(dá)，說明在外囊壁成骨誘導(dǎo)鈣化上二者成骨作用顯著，協(xié)同誘導(dǎo)、加強了外囊壁鈣化。雌激素受體α在成骨因子基因表達(dá)水平具有重要的作用，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，引起鈣鹽沉積[17]，形成鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅與鈣離子以螯合的方式形成復(fù)合物，用來識別組織細(xì)胞的鈣鹽成分，通過茜素紅染色，產(chǎn)生紅色沉積(即鈣結(jié)節(jié))，所以實驗首先通過茜素紅染色求證所選鈣化外囊壁和非鈣化外囊壁之間的鈣化差異情況，結(jié)果顯示與非鈣化外囊壁相比較，鈣化外囊壁鈣鹽紅色彌漫沉積更多，鈣化作用更強。接著實驗運用免疫組織化學(xué)和qRT-PCR方法檢測BMPRⅡ、IGF1R和ERα，統(tǒng)計結(jié)果顯示與非鈣化外囊壁相比，鈣化的外囊壁組織棕黃色著色更強，說明鈣化外囊壁表達(dá)的BMPRⅡ、IGF1R和ERα等受體較高，鈣化外囊壁組織中表達(dá)BMPRⅡ、IGF1R和ERα的mRNA的量更高，這也說明在鈣化的肝細(xì)粒棘球蚴外囊壁組織中這些受體的表達(dá)水平更高。

外囊壁成纖維細(xì)胞能向成骨細(xì)胞方向分化,同時鈣化相關(guān)調(diào)節(jié)因子與受體BMPRⅡ、IGF1R和ERα結(jié)合參與誘導(dǎo)成骨潛能，調(diào)節(jié)外囊壁細(xì)胞的成骨作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞的礦化能力，相互影響外囊壁的鈣化。外囊壁鈣化在一定程度上限制了細(xì)粒棘球蚴的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制了細(xì)粒棘球蚴的生長。通過增加這些鈣化因子的量，促進(jìn)囊周纖維囊壁的鈣化，可能達(dá)到抑制寄生蟲的目的，轉(zhuǎn)變傳統(tǒng)殺死細(xì)粒棘球蚴本身的藥物治療靶點，為細(xì)粒棘球蚴病患者提供一個新的治療手段。

但機體鈣化調(diào)控機制是極為復(fù)雜的，包括細(xì)胞、體液、激素等不同水平的調(diào)控機制，這些鈣化因子調(diào)控外囊壁細(xì)胞成骨作用可能只是冰山一角，整體的非特異性的阻斷和增強細(xì)胞因子可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良后果。目前尚有許多問題需進(jìn)一步研究，生物學(xué)中新技術(shù)及新思路的發(fā)展將有助于從復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中確定出在外囊壁鈣化中敏感的關(guān)鍵的步驟，以此而促進(jìn)療效高、特異性強、副作用少的藥物的研發(fā)及新治療措施的發(fā)展。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.004

通訊作者：吳向未，Email:wxwshz@126.com

中圖分類號：R383

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0332-06

Corresponding author:Wu Xiang-wei, Email: wxwshz@126.com

收稿日期：2015-08-24修回日期：2015-12-16

Calcium related receptors of the pericyst of hepatic cystic echinococcosis

ZHANG Xu-yong1, YANG Tao1, WANG Si-bo1, XIA Jie1, GUO Jun1, YIN Shuang-hong2,CHEN Xue-ling3, WU Xiang-wei1

(1.DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832008,China;2.CollegeofNursing,TongrenUniversity,Tongren554300,China;3.DepartmentofImmunology,CollegeofMedicine,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China)

Abstract:To compare the differential expression of BMPRⅡIGF1R and ERα between calcified hydatid pericyst wall and non-calcified hydatid pericyst wall, we detected the expression of BMPRⅡIGF1R and ERα in calcified pericyst wall and non-calcified pericyst wall of hepatic cystic echinococcosis respectively with Alizarin Red stainingenvision immuno-histochemical method and qRT-PCR. In comparison with non-calcified hydatid pericyst wall, the red calcified nodes of Alizarin Red staining on the calcified hydatid pericyst wall were obviously increased, and differences were statistically significant (χ2=20.369, P<0.01). The expression levels of BMPRⅡIGF1R and ERα were much higher in calcified hydatid pericyst wall than those in non-calcified hydatid pericyst wall with statistical significance (P<0.05). Compared with control groups, the mRNA relative expression levels of BMPRⅡIGF1R and ERα were statistically higher in calcified pericyst wall group (P<0.05). The expression levels of these calcium related receptor were higher in calcified hydatid pericyst wall than those in non-calcified hydatid pericyst wall. Cytokines binding with these calcium related receptors may contribute to the response; calcified hydatid pericyst wall may inhibit Echinococcus granulosus and plays an important role on treatment of hepatic cystic echinococcosis.

Keywords:hepatic cystic echinococcosis; calcified hydatid pericyst wall;BMPRⅡ; IGF1R; ERα

國家自然科學(xué)基金(No.81260412，81360453)資助