中國萊姆病螺旋體菌株bmpA基因中人B細(xì)胞表位多態(tài)性分析

劉慧鑫，郝　琴，劉　煒，侯學(xué)霞，張　琳，萬康林

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中國萊姆病螺旋體菌株bmpA基因中人B細(xì)胞表位多態(tài)性分析

劉慧鑫1，郝琴2，劉煒2，侯學(xué)霞2，張琳2，萬康林2

1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,溫州325035；2.中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京102206

摘要：目的研究我國伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi sensu lato),即萊姆病螺旋體菌株中bmpA基因及其人B細(xì)胞表位區(qū)的序列多態(tài)性。方法選取61株萊姆病螺旋體分離株，PCR擴(kuò)增其bmpA基因并測序后，結(jié)合4種基因型參考菌株序列，與從免疫表位數(shù)據(jù)庫(Immune Epitope Database，IEDB)中查詢到的B細(xì)胞表位序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果中國B.garinii基因型菌株的cluster2、cluster3以及B.afzelii和B.valaisiana基因型所有菌株與參考序列比對后發(fā)現(xiàn)分別有3、9、5和18個異義突變。B細(xì)胞表位改變主要發(fā)生在B.afzelii基因型全部分離株和B.garinii基因型的cluster3及5株非成簇菌株。B.afzelii基因型菌株在B細(xì)胞表位區(qū)的異義突變A125S影響了2個B細(xì)胞表位；B.garinii基因型的cluster3和5株非成簇菌株B細(xì)胞表位區(qū)的3個異義突變導(dǎo)致5個B細(xì)胞表位均發(fā)生改變。結(jié)論中國萊姆病螺旋體bmpA基因在4種基因型間和B.garinii基因型內(nèi)存在較大多態(tài)性。

關(guān)鍵詞：萊姆病螺旋體；bmpA；B細(xì)胞表位；多態(tài)性

Supported by the National Science and Technology Major Project for Infectious Diseases (No.2013ZX10004-001)

萊姆病(Lyme disease，LD)是美國Steere AC博士在1977年首次報(bào)告，由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferisensulato)，即萊姆病螺旋體引起的一種蜱傳感染性人獸共患病[1-2]。現(xiàn)已有世界五大洲70多個國家報(bào)告發(fā)現(xiàn)有萊姆病的存在，我國20個省、市、自治區(qū)的病人、蜱、野鼠和野兔中已分離到萊姆病螺旋體[3]。萊姆病的臨床表現(xiàn)多種多樣，典型癥狀為游走性紅斑(erythema migrans,EM)，感染后期可引起關(guān)節(jié)、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重者可致殘甚至死亡[4-6]。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，萊姆病的早期診斷已成為研究熱點(diǎn)。一些研究證實(shí)OspC、VlsE、flagellin(FlaB)、BmpA、P66、DbpA和DbpB可用于萊姆病的診斷[7-9]。

Bmp家族蛋白由染色體編碼，包括BmpA、BmpB、BmpC和BmpD[10]。4種蛋白氨基酸序列相似度在36%～64%[11]。BmpB、BmpC和BmpD的研究較少，而大量研究證實(shí)BmpA是萊姆病螺旋體的早期表達(dá)蛋白，分子量約39 KiloDalton,即P39。P39是一種層粘連蛋白結(jié)合蛋白，與萊姆病中關(guān)節(jié)炎的致病有關(guān)[10]。

本研究中，我們選取了61株國內(nèi)萊姆病螺旋體的分離株，擴(kuò)增其BmpA基因，測序后分析了該基因的人B細(xì)胞表位序列的多態(tài)性，為萊姆病的早期診斷和亞單位疫苗研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1菌株來源從菌株庫中選取61株萊姆病螺旋體分離株作為本次研究的樣本，根據(jù)我國各基因型菌株比例[12]，選取Borreliaburgdorferisensustricto(B.b.s.s) 1株，Borreliagarinii(B.garinii) 41株，Borreliaafzelii(B.afzelii) 15株，Borreliavalaisiana(B.valaisiana) 4株。各菌株省份來源見表1。

表161株分離株的地理分布和基因型信息

Tab. 1Geographic distribution and genotype data of 61 B.burgdorferi sensu lato strains

地區(qū)Area菌株數(shù)No.ofstrains基因型GenotypeJilin12B.gariniiGuangdong1B.gariniiInnerMongolia8B.gariniiShandong1B.afzeliiLiaoning1B.afzeliiGuizhou73B.afzelii,4B.valaisianaSichuan6B.afzeliiHeilongjiang86B.garinii,2B.afzeliiXinjiang13B.gariniiBeijing2B.afzeliiHebei1B.gariniiHunan1B.bssTotal61-

同時，我們從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information, NCBI)網(wǎng)站中下載了1株B.b.s.s(B31, AE000783),3株B.garinii(PBi, CP000013.1; BgVir, NC_017717.1; NMJW1, CP003866.1)，3株B.afzelii(PKo,CP002933.1; K78, CP009058.1; Tom3107, CP009212.1)和2株B.valaisiana(VS116, ABCY02000001.1; Tom4006, CP009117.1)菌株的bmpA等位基因序列。

1.2bmpA基因擴(kuò)增和序列測定根據(jù)B.b.s.s菌株B31中的bmpA基因，使用Primer5設(shè)計(jì)PCR引物，正、反向引物分別為5′-CCATGGTATCTTGTAGTGGTAA-3′和5′-TTAAATAAATTCTTTAAGAAAC-3′。PCR擴(kuò)增的總反應(yīng)體系為25 μL，其中2xPCR緩沖液12.5 μL，正、反向引物各100 nmol/L，4種dNTP各200 μmol/L和0.5 U的DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性10 min，然后94 ℃變性45 s，45 ℃復(fù)性45 s，72 ℃延伸1 min重復(fù)35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物送測序公司雙向測序并拼接。

1.3bmpA基因中B細(xì)胞表位區(qū)的確定檢索免疫表位數(shù)據(jù)庫(Immune Epitope Database, IEDB)[13]，獲得Borreliaburgdorferi中存在的人B細(xì)胞表位序列，與B31菌株的bmpA基因序列進(jìn)行比對，完全匹配的表位序列用于多態(tài)性分析。

1.4數(shù)據(jù)分析所有菌株bmpA基因的測序拼接結(jié)果用MEGA5.1軟件[14]進(jìn)行alignment操作，根據(jù)測序結(jié)果最長可信序列比對分析bmpA基因的109～966 bp(37～322氨基酸)。所用參考菌株為B.b.s.s-B31、B.garinii-NMJW1、B.afzelii-Tom3107和B.valaisiana-Tom4006。

2結(jié)果

2.1bmpA基因中人B細(xì)胞表位的信息經(jīng)檢索IEDB及與B31菌株bmpA基因序列比對后，在B31菌株的bmpA基因中發(fā)現(xiàn)了5個B細(xì)胞表位，以及各基因型菌株中B細(xì)胞表位序列，見表2。

2.2菌株聚類分析結(jié)果基于BmpA蛋白的氨基酸序列，用MEGA5.1軟件采用neighbor-jioning方法對所有菌株進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示B.garinii基因型菌株主要聚類為cluster1、cluster2和cluster3，B.b.s.s、B.afzelii、B.valaisiana基因型菌株的聚類結(jié)果與郝琴M(fèi)LSA[12]結(jié)果一致。JC1-7菌株在郝琴M(fèi)LSA研究和其他蛋白抗原人B細(xì)胞表位多態(tài)性研究(數(shù)據(jù)未顯示)中聚類結(jié)果均為B.garinii，而在BmpA氨基酸序列聚類結(jié)果中為B.afzelii，見圖1。

表2　各基因型菌株bmpA基因序列中B細(xì)胞表位的分布信息

#IEDB為免疫表位數(shù)據(jù)庫(Immune Epitope Database)；起始位置和終止位置均為氨基酸位置。

Note:#IEDB, Immune Epitope Database; Start position and stop position are all means of the position of amino acid.

2.3bmpA基因中的異義突變經(jīng)序列比對分析發(fā)現(xiàn)，萊姆病螺旋體4個基因型參考菌株BmpA蛋白氨基酸序列的相似度為83.9%，見圖2；我國B.b.s.s菌株CS4和B.gariniicluster1菌株的BmpA氨基酸序列與相應(yīng)基因型參考序列完全相同。國內(nèi)B.garinii的cluster2、cluster3以及B.afzelii和B.valaisiana所有菌株與參考序列比對后發(fā)現(xiàn)分別有3、9、5和18個異義突變，詳細(xì)突變位置和突變類型見表3。

2.4bmpA基因中B細(xì)胞表位區(qū)的變異61株中國萊姆病螺旋體分離株中，B.b.s.s、B.valaisiana基因型分離株及B.garinii基因型的cluster1和cluster2分離株的B細(xì)胞表位區(qū)與相應(yīng)基因型參考序列完全相同，在B細(xì)胞表位區(qū)未發(fā)生異義突變。B細(xì)胞表位改變主要發(fā)生在B.afzelii基因型全部分離株和B.garinii基因型的cluster3及5株非成簇菌株。B.afzelii基因型菌株在B細(xì)胞表位區(qū)的異義突變A125S影響了2個B細(xì)胞表位；B.garinii基因型的cluster3和5株非成簇菌株B細(xì)胞表位區(qū)的3個異義突變導(dǎo)致5個B細(xì)胞表位均發(fā)生改變。見表4。

3討論

本研究中，根據(jù)MLSA分型中國萊姆病螺旋體菌株各基因型的比例，我們選取了61株中國萊姆病螺旋體的分離株，這些分離株的來源地區(qū)幾乎完全覆蓋了我國萊姆病的發(fā)病疫區(qū)，采用PCR和測序的方法，對其bmpA基因和B細(xì)胞表位進(jìn)行多態(tài)性分析。菌株的代表性較好，分析結(jié)果可信度較高。

萊姆病螺旋體的BmpA蛋白表達(dá)于萊姆病早期免疫反應(yīng)中，其結(jié)構(gòu)暴露于萊姆病螺旋體的外膜，是一種表面暴露的外膜脂蛋白[15-16]。BmpA蛋白作為萊姆病螺旋體的外膜組成成分，通過與宿主的層粘連蛋白結(jié)合在侵襲宿主時發(fā)揮作用[10]。此外，該蛋白還是萊姆病關(guān)節(jié)炎的主要致病因子，U.Pal和P.Wang的研究[17]證實(shí)萊姆病螺旋體bmpA突變株不能侵犯鼠關(guān)節(jié)組織，進(jìn)一步證實(shí)了BmpA蛋白的作用。BmpA作為一種早期表達(dá)蛋白，已用于萊姆病的血清學(xué)診斷。

圖1　61株萊姆病螺旋體分離株基于BmpA氨基酸序列聚類分析圖Fig.1　Phylogenetic tree for the sequence of BmpA amino acid of 61 B.bsl strains

表3萊姆病螺旋體菌株bmpA基因中的異義突變

Tab.3Nonsynonymous mutations founded in bmpA gene of B.bsl strains

基因型Genotypes菌株Strains位置AAPo#變異類型AAMu*B.gariniicluster2167S-A188Y-p66D-Ncluster3107S-P122P-A161K-E167S-A178Y-H188Y-p66D-N282R-K297K-RB.afzeliiallstrains60K-E125A-S257T-S266N-Y279E-DB.valaisianaallstrains64V-I69S-T94R-K99A-S101V-A120N-D148V-I162S-G186F-S188H-Q196L-I199S-G202I-V204I-T225A-S277T-A309E-K313I-L

#AA Po代表氨基酸位置；*AA Mu代表氨基端突變類型。

Note: AA Po, amino acid position; AA Mu, amino acid mutation.

注：該基因B細(xì)胞表位區(qū)在圖中框出；相同序列和變異序列分別用省略號和陰影標(biāo)注。Note: The B epitope region was boxed in BmpA of B31; the same region and variable region were separately labeled by dots and shadows.圖2　各基因型參考菌株BmpA氨基酸序列異質(zhì)性Fig.2　Heterogeneity of BmpA amino acid sequence in four genotypes

表4萊姆病螺旋體菌株bmpA基因中的變異對B表位區(qū)的影響

Tab.4Effects to the B epitope regions of the mutations in bmpA

菌株Strains受影響的表位編號No.ofaffectedBepitopeMLSA基因型MLSAgenotypeCluster39653B.gariniiJN159653,3350B.gariniiHS2,HS3,Y6A,JC2-2,JN153350,21352,21353,53186B.gariniiB.afzelii9653,3350B.afzelii

在本研究中，基于BmpA蛋白氨基酸序列的聚類結(jié)果中，JC1-7菌株與B.afzelii基因型菌株聚為一簇，而在郝琴研究[12]中該菌株與B.garinii基因型菌株聚為一簇，這可能是bmpA基因發(fā)生基因交換所致。許多研究證實(shí)，基因交換現(xiàn)象常發(fā)生在萊姆病螺旋體ospC基因中[18-20]。

B.afzelii(含JC1-7)和B.valaisiana基因型菌株與俄羅斯參考菌株Tom3107和Tom4006比對,發(fā)現(xiàn)分別有5和18個異義突變。B.afzelii基因型菌株的125位突變位于B細(xì)胞表位區(qū)，導(dǎo)致2個B細(xì)胞表位受影響；B.valaisiana基因型的異義突變均位于非表位區(qū)，B細(xì)胞表位未受影響。但是兩個基因型內(nèi)的中國菌株BmpA氨基酸序列完全相同，這說明我國B.afzelii和B.valaisiana菌株基因型內(nèi)高度保守。我國B.afzelii和B.valaisiana基因型菌株與參考菌株之間的異義突變可能是受地域差異的影響。由于B.valaisiana基因型菌株較少，需要進(jìn)一步擴(kuò)大菌株量進(jìn)行驗(yàn)證。

B.b.s.s基因型CS4菌株的BmpA氨基酸序列與所選參考菌株序列相同，因B.b.s.s基因型菌株主要在美國致病而歐洲和亞洲少見[4]，本課題組僅有一株，故只有一株用于分析。我國B.garinii基因型菌株聚類分析分為cluster1、cluster2、cluster3和5株非成簇菌株。cluster1與所選中國參考菌株的BmpA氨基酸序列相同且為菌株數(shù)量最多的一簇；我國B.garinii的cluster2、cluster3與參考序列比對后發(fā)現(xiàn)分別有3和9個異義突變。cluster2和cluster3菌株與菌株NMJW1的BmpA的序列比對分別有3和9個異義突變，cluster2菌株的突變均位于非表位區(qū)而cluster3菌株的122位突變導(dǎo)致一個B細(xì)胞表位受影響；5株非成簇菌株在B細(xì)胞表位的3個異義突變使5個B細(xì)胞表位均受影響。說明B.garinii基因型內(nèi)菌株存在較大的異質(zhì)性。

4結(jié)論

在我國萊姆病螺旋體菌株的bmpA基因可能存在基因交換現(xiàn)象；BmpA蛋白在4種基因型間和B.garinii基因型內(nèi)存在較大異質(zhì)性，該蛋白用于萊姆病早期血清學(xué)診斷時應(yīng)考慮這種異質(zhì)性以提高檢測的靈敏度。

參考文獻(xiàn)：

[1]Steere AC, Malawista SE, Hardin JA, et al.Erythemachronicummigrans andLymearthritis. The enlarging clinical spectrum [J]. Ann Intern Med, 1977, 86(6): 685-698. DOI: 10.7326/0003-4819-86-6-685

[2]Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, et al. Lyme disease-a tick-borne spirochetosis?[J]. Science, 1982, 216(4552): 1317-1319. DOI: 10.1126/science. 7043737

[3]Wan KL, Zhang ZF, Dou GL. Investigation on primary vector ofBorreliaburgdorferiin China[J]. Chin J Epidemiology, 1998, 19(5): 263-266.(in Chinese).

萬康林, 張哲夫, 竇桂蘭. 中國萊姆病螺旋體主要生物媒介的調(diào)查研究[J]. 中華流行病學(xué)雜志, 1998, 19(5): 263-266.

[4]Stanek G, Wormser GP, Gray J, et al. Lyme borreliosis[J]. Lancet, 2012, 379(9814): 461-473. DOI: 10.1016/S0140-6736(11)60103-7

[5]Stanek G, Strle F. Lyme borreliosis[J]. Lancet, 2003, 362(9396): 1639-1647. DOI: 10.1016/S0140-6736(03)14798-8

[6]Steere AC, Coburn J, Glickstein L. The emergence of Lyme disease[J]. J Clin Invest, 2004, 113(8): 1093-1101. DOI: 10.1172/JCI200421681

[7]Tong YP, Feng FB, Bi SL, et al. Molecular cloning and expression inBorreliaburgdorferiP39 geneE.coli[J]. Chin J Zoonoses, 2000, 16(4): 9-11.(in Chinese)

佟玉品, 馮方波, 畢勝利, 等. 萊姆病螺旋體P39蛋白的基因克隆及在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J]. 中國人獸共患病雜志, 2000, 16(4): 9-11.

[8]Salo J, Jaatinen A, Soderstrom M, et al. Decorin binding proteins ofBorreliaburgdorferipromote arthritis development and joint specific post-treatment DNA persistence in mice[J]. PLoS One, 2015, 10(3): e0121512. DOI: 10.1371/journal.pone.0121512

[9]Arnaboldi PM, Seedarnee R, Sambir M, et al. Outer surface protein C peptide derived fromBorreliaburgdorferisensu stricto as a target for serodiagnosis of early lyme disease[J]. Clin Vaccine Immunol, 2013, 20(4): 474-481. DOI: 10.1128/CVI.00608-12

[10]Verma A, Brissette CA, Bowman A, et al.BorreliaburgdorferiBmpA is a laminin-binding protein[J]. Infect Immun, 2009, 77(11): 4940-4946. DOI: 10.1128/IAI.01420-08

[11]Ramamoorthy R, Povinelli L, Philipp MT. Molecular characterization, genomic arrangement and expression of bmpD, a new member of the bmp class of genes encoding membrane proteins ofBorreliaburgdorferi[J]. Infect Immun, 1996, 64(4): 1259-1264.

[12]Hao Q, Hou X, Geng Z, et al. Distribution ofBorreliaburgdorferisensulatoin China[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(2): 647-650. DOI: 10.1128/JCM.00725-10

[13]Vita R, Zarebski L, Greenbaum JA, et al. The immune epitope database 2.0[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(Database issue): 11. DOI: 10.1093/nar/gkp1004

[14]Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Mol Biol Evol, 2011, 28(10): 2731-2739. DOI: 10.1093/molbev/msr121

[15]Shin JJ, Bryksin AV, Godfrey HP, et al. Localization of BmpA on the exposed outer membrane ofBorreliaburgdorferiby monospecific anti-recombinant BmpA rabbit antibodies[J]. Infect Immun, 2004, 72(4): 2280-2287. DOI: 10.1128/IAI.72.4.2280-2287.2004

[16]Bryksin AV, Tomova A, Godfrey HP, et al. BmpA is a surface-exposed outer-membrane protein ofBorreliaburgdorferi[J]. FEMS Microbiol Lett, 2010, 309(1): 77-83. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2010.02020.x

[17]Pal U, Wang P, Bao F, et al.Borreliaburgdorferibasic membrane proteins A and B participate in the genesis ofLymearthritis[J]. J Exp Med, 2008, 205(1): 133-141. DOI: 10.1084/jem.20070962

[18]Jauris-Heipke S, Liegl G, Preac-Mursic V, et al. Molecular analysis of genes encoding outer surface protein C (OspC) ofBorreliaburgdorferisensulato: relationship to ospA genotype and evidence of lateral gene exchange of ospC[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(7): 1860-1866.

[19]Qiu WG, Bruno J F, McCaig WD, et al. Wide distribution of a high-virulenceBorreliaburgdorfericlone in Europe and North America[J]. Emerg Infect Dis, 2008, 14(7): 1097-1104. DOI: 10.3201/eid1407.070880

[20]Qiu WG, Schutzer SE, Bruno JF, et al. Genetic exchange and plasmid transfers inBorreliaburgdorferisensu stricto revealed by three-way genome comparisons and multilocus sequence typing[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(39): 14150-14155. DOI: 10.1073/pnas.0402745101

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.002

通訊作者：萬康林，Email: wankanglin@icdc.cn

中圖分類號：R377

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694-(2016)04-0321-06

Corresponding author:Wan kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn

收稿日期：2016-01-06；修回日期:2016-03-17

Polymorphisms of human B cell epitopes in bmpA of Borrelia burgdorferi sensu lato in China

LIU Hui-xin1, HAO Qin2, LIU Wei2, HOU Xue-xia2, ZHANG Lin2, WAN Kang-lin1

(1.SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;2.StateKeyLaboratoryofInfectiousDiseasesPreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

Abstract:To study the polymorphism in bmpA and its human B cell epitopes of Borrelia burgdorferi strains in China, the bmpA sequences of 61 B.burgdorferi strains were obtained by PCR and sequencing. They were compared with the human B cell epitope sequences from Immune Epitope Database (IEDB) based on the reference strain of each genotype. The 3, 9, 5 and 18 nonsynonymous mutations were seperately found in cluster2 and cluster3 of B.garinii, B.afzelii and B.valaisiana strains in China. The changed B cell epitopes were mainly found in cluster3 and five non-clustered strains of B.garinii and B.afzelii strains. The nonsynonymous mutation of A125S in B.afzelii strains affected two B cell epitopes. Three nonsynonymous mutations in cluster3 and five non-clustered strains in B.garinii affected all of five B cell epitopes. The polymorphysims were widely existed in bmpA and its B cell epitopes in B.garinii and between four genotypes of B.burgdorferi strains selected in China.

Keywords:Borrelia burgdoferi; bmpA; B cell epitope; polymorphism

國家科技重大專項(xiàng)課題(No.2013ZX10004-001)資助