結核分枝桿菌rpoB基因突變特征與利福平耐藥水平關系的研究

胡族瓊，劉燕文，周　文，高璐璐，陳俊宇，謝偉勝，周德旺，曾少芳，鐘炳棠

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結核分枝桿菌rpoB基因突變特征與利福平耐藥水平關系的研究

胡族瓊1，劉燕文1，周文2，高璐璐3，陳俊宇1，謝偉勝1，周德旺1，曾少芳1，鐘炳棠1

1.國家呼吸疾病重點實驗室結核病室，廣州市胸科醫院檢驗科，廣州510095；2.廣州市越秀區疾病預防控制中心，廣州510513；3.廣州空軍后勤部，廣州510523

摘要：目的了解結核分枝桿菌rpoB基因突變特征與利福平耐藥水平的關系。方法測定266株(109株利福平耐藥株，157株利福平敏感株)結核分枝桿菌利福平MIC值及其rpoB基因序列，分析不同突變特征的菌株其利福平MIC值的差異。結果109株利福平耐藥株rpoB基因皆發生錯義突變，常見突變密碼子531與526的突變頻率分別為69.7%與17.4%。利福平耐藥株中單密碼子突變株占82.6%，多重密碼子突變株占17.4%。531單密碼子突變株與526單密碼子突變株之間平均利福平MIC值差異無統計學意義(P=0.87)，但兩獨立樣本T檢驗分析顯示，多重密碼子突變株平均利福平MIC值(115.8 μg/mL)顯著高于單密碼子突變株平均利福平MIC值(48.4 μg/mL)(t=2.659，P=0.016)。利福平敏感株未發生錯義突變。5.5%(6/109)的利福平耐藥株僅在rpoB基因起始端發生突變，突變密碼子分別是247,251和253。結論531與526是最常見突變密碼子，且以單密碼子突變為主；531與526單密碼子突變株之間利福平耐藥水平差異無統計學意義，但多重密碼子突變株利福平耐藥水平顯著高于單密碼子突變株利福平耐藥水平；rpoB基因起始端突變可能是除利福平耐藥決定區域之外導致利福平耐藥的第2個耐藥決定區；rpoB基因DNA序列分析有助于結核分枝桿菌利福平耐藥表型和耐藥水平的預測。

關鍵詞：結核分枝桿菌；rpoB突變；利福平；耐藥水平；最低抑菌濃度

Supported by the Research Project on Medical Science in Guangdong Province(No. A2013530)

利福平是一線抗結核藥物中的關鍵藥物，其耐藥機制與編碼RNA聚合酶β-亞基的rpoB基因突變有關，特別與該基因中利福平耐藥決定區(rifampicin resistance-determining region, RRDR)的突變有關[1-2]。利福平耐藥結核分枝桿菌通常同時對異煙肼耐藥，從而容易形成耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)。有效控制耐多藥結核病的傳播是降低結核病致死率的有效措施，但是耐多藥結核病難以治愈，費用昂貴，常依賴于毒副作用更大的二線抗結核藥物[3-7]。在全球抗結核藥物匱乏的現況下，高劑量莫西沙星治愈低水平氟喹諾酮類耐藥結核病和高劑量異煙肼治療耐多藥結核病療效顯著的報道[8-9]提示，提高利福平劑量有可能治愈低水平利福平耐藥的結核病。利福平耐藥水平是通過測定利福平最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)值來表示，而利福平MIC值的測定依賴于結核分枝桿菌的生長，結核分枝桿菌生長緩慢延遲了利福平耐藥水平的獲得。

了解rpoB基因突變特征與利福平耐藥水平的關系有利于快速獲得利福平耐藥水平以便于制定治療方案和闡明利福平耐藥機制。目前為止，僅少數研究人員報道過利福平耐藥水平與rpoB基因突變特征之間的關系[10-18]。但可能由于資源不足，他們多采用小樣本研究而達不到統計分析的樣本量要求，且研究結果常因地域不同而發生分歧[10-18]。為此，本研究采用266株結核分枝桿菌測定其利福平MIC值和rpoB基因核苷酸序列，以探索rpoB基因突變特征與利福平耐藥水平之間有無相關性。

1材料與方法

1.1菌株266株結核分枝桿菌分離自2012年8月至2013年11月來廣州市胸科醫院就診的門診患者和住院患者，包括初診患者和復診患者，菌株無重復收集。患者年齡12～79歲，平均年齡46.5歲，男性190人，女性76人?；颊邅碜詮V東194人，廣西14人，海南16人，福建17人，四川16人，江西9人。所有患者在本次研究進行之前已用MGIT 960(Becton & Dickinson)完成常規一線藥物的敏感性測定，為了保證研究結果的準確性，在本研究進行之前又采用同樣方法單獨對利福平敏感性進行測定。標準株H37Rv作利福平敏感株對照加入至本研究中。

1.2MIC值測定先配制7H9肉湯(4.7 g 7H9瓊脂粉+蒸餾水900 mL+甘油2 mL)，高壓10 min，使用前加入100 mL MGIT生長添加劑OADC，以此肉湯現用現配制利福平溶液與細菌懸液。取96孔板1個，第1孔與第3～12孔加入100 μL 7H9肉湯，取200 μL配制好的利福平藥液至第2孔，再從第2孔取100 μL至第3孔混勻后再取100 μL至第4孔，以此類推至第11孔混勻后棄去100 μL含利福平的7H9混合液，第12孔作無菌無藥的陰性對照，再加入6×106CFU/ML的菌液100 μL至第1到第11孔。考慮到利福平耐藥株的MIC值可能比較高，敏感株的MIC值可能比較低，因此分別配制不同濃度的利福平溶液。最終用于測定耐藥株MIC值的96孔板上的利福平終濃度分別為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/mL；測定敏感株的利福平終濃度分別為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 μg/mL。封板后置37 ℃孵育4周觀察結果，讀取最低抑菌濃度值。

1.3引物設計根據基因庫記載的rpoB基因(Rv0677)序列，利用軟件Primer Premier 5.0(Premier, Canada) 設計引物KH-12035(5′-CGAGGACTTGACGGCAGACGCT-3′)和KH-12036(5′-AACCACGCCGTCGACCACCT-3′)，由上海生工合成。PCR產物全長1 924 bp包括rpoB起始密碼子上游-370 nt至+1554 nt。其余測序引物(HC-11070-F1: 5′-CCGATGATGACCGAGAA-3′和HC-11072-F2: 5′-CCACGATGACCGTTCCG-3′由測序公司華大基因公司合成。

1.4DNA提取DNA提取試劑采用德國進口的GenoLyse VER 1.0(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)試劑盒，具體操作過程詳見說明書。

1.5擴增目的基因PCR反應體系50 μL，分別由0.25 μL PrimerSTAR HSpolymerase(TaKaRa)、5 μL 10×Primer STAR buffer(TaKaRa)、8 μL 2.5 mmol/L dNTP mixture(TaKaRa)、0.2 μL引物KH-12035(20 μmol/L)、0.2 μL引物KH-12036(20 μmol/L)、31.35 μL滅菌水、5 μL DNA模板組成50 μL總反應體系。PCR反應條件：94 ℃，變性3 min；94 ℃，1 min, 60 ℃，1 min , 72 ℃，1 min，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物全長1 924 bp。

1.6DNA測序及序列分析PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后送華大基因公司測序，華大基因公司先對PCR產物純化后再測序。采用標準Sanger DNA測序法在3730XL(Applied Biosystems)測序儀上進行測定，所測序列由生物信息軟件Clustalx 和 DANstar聯合分析，分析結果見表1和表2。

表1　90株利福平耐藥結核分枝桿菌的單密碼子突變類型及其利福平MIC值(μg/mL)

b.本次研究中的新發突變類型。

b. The novel mutations in this study.

表2　19株利福平耐藥結核分枝桿菌rpoB基因的多重突變類型及其利福平MIC值

b.本次研究中的新發突變類型。

b. The novel mutations in this study.

1.7統計學分析使用SPSS 18.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)t檢驗分析rpoB單重突變和多重突變菌株之間利福平MIC值差異，以及常見526單密碼突變株和531單密碼突變株之間利福平MIC值差異，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1利福平藥敏結果266株臨床菌株中，利福平敏感株157株，利福平耐藥株109株。標準株H37Rv為利福平敏感株。全部利福平耐藥菌株的MIC值見表1和表2，敏感株的MIC值見表3。

表3　157株利福平敏感株rpoB基因突變類型及其利福平MIC值

表4　單重突變株與多重突變株RIF平均MIC值比較

2.2rpoB基因的突變類型與分布情況根據我們之前的研究結果以及本研究進行前對16株菌株的全序列測定結果顯示，絕大部分單密碼子突變發生在rpoB基因前半部分，主要發生在第593位密碼子之前[19]。為了降低研究成本，本研究主要對第593位密碼子之前的序列進行分析。結果顯示，一共發現36種錯義突變形式，其中15種突變是本次研究新發現的突變類型，所有突變形式中14種突變類型為單密碼子突變(n=90)，多重突變類型有19種，分別發生于19株菌株中，見表1和表2。利福平耐藥株rpoB基因中531(69.7%)與526(17.4%)密碼子依然是最常見的突變密碼子。94.5%(103/109)的利福平耐藥株至少有1個突變位點發生在RRDR之內，其余5.5%(6/109)利福平耐藥株所有突變位點都發生在RRDR之外(V251A [n=1], V251F [n=2], V251L [n=1], Q253L [n=1], E247Q [n=1])。有2株利福平耐藥株的同義突變發生在RRDR之內(L533, 533:CTG→CTC和T525, 525: ACC→ACG)，還有2株利福平耐藥株的同義突變發生在RRDR之外(P480, 480:CCA→CCG和I569, 569: ATC→ATT)。H37Rv無任何突變發生。4株利福平敏感株在RRDR之外發生同義突變(G457,457:GGC→GGT; L397, 397:CTG→CTC; K238, 238:AAG→AAA; D84, 84: GAT→GAC)，其余利福平敏感株的rpoB基因未發現任何突變。

2.3利福平耐藥株MIC值與rpoB基因突變類型的關系本研究中，109株利福平耐藥株的耐藥水平在10～320 μg/mL之間，其平均MIC值為60.15 μg/mL(見表1和表2)；157株利福平敏感株的利福平最低抑菌濃度值為0.156～0.312 5 μg/mL之間，其平均MIC值為0.27 μg/mL。利福平耐藥株的平均MIC值顯著高于利福平敏感株的平均MIC值(t=9.955，P=0.000)。4株251單密碼子突變(V251A[n=1],V251F[n=2],V251L[n=1])的利福平耐藥株其MIC值范圍在10～80 μg/mL之間；4株516單密碼子突變株(D516G[n=1],D516V[n=3])的MIC值范圍在40～80 μg/mL之間；12株526單密碼子突變株的利福平MIC值范圍在20～80 μg/mL之間，其平均MIC值為48.3 μg/mL；67株531單密碼子突變株的利福平MIC值范圍在20～80 μg/mL之間，其平均MIC值為49.6 μg/mL。526單密碼子突變株的平均MIC值與531單密碼子突變株的平均MIC值比較差異無統計意義(t=0.164,P=0.87)。90株單密碼子突變株的利福平平均MIC值為48.4 μg/mL，19株多重密碼子突變株的利福平平均MIC值為115.8 μg/mL，該二類菌株利福平平均MIC值比較t檢驗結果顯示，多重突變株MIC值高于單密碼子突變株的MIC值(t=2.659,P=0.016)。

3討論

本次研究結果顯示，所有利福平耐藥株rpoB基因都發生了錯義突變，而利福平敏感株未發生錯義突變，該結果與以往研究結果一致，即rpoB基因編碼的RNA多聚酶β亞基的氨基酸突變是利福平耐藥的主要機制[2]。

序列分析顯示，266株菌株的rpoB基因一共發生了36種錯義突變形式，另外還發現8種無意義突變分別存在于4株利福平耐藥株和4株利福平敏感株中，這類無意義突變將導致利用分子診斷技術檢測利福平耐藥的準確性降低。526和531仍然是常見突變密碼子，其突變頻率分別是17.4%和69.7%，與其他地區的研究結果類似[20-25]。109株利福平耐藥株中，5.5%(n=6)的菌株rpoB基因突變皆位于RRDR之外的rpoB基因起始端，其利福平耐藥程度與516、526、531單密碼子突變株相近。由于本研究采用大腸桿菌編碼系統進行密碼子命名，如果采用結核分枝桿菌編碼系統進行命名，251密碼子在結核分枝桿菌編碼系統中則是176密碼子，該密碼子是以往研究者們較常發現的一個位于rpoB基因起始端的密碼子[19,26-28]。密碼子253和247在結核分枝桿菌編碼系統中分別是178和172密碼子，皆位于rpoB基因起始端。本次研究發現位于rpoB基因起始端的密碼子突變頻率大于我們上次的研究結果[19]，該結果提示，除RRDR之外，將rpoB基因起始端作為檢測靶標診斷利福平敏感性將會提高現有分子診斷技術的敏感性。

t檢驗分析526和531單密碼子突變株之間利福平平均MIC值結果顯示差異無統計學意義(P=0.87)，我們同時分析美國報道的516，526，531和533單密碼子突變株之間的利福平平均MIC值，其結果也顯示無顯著性差異(F=2.587,P=0.058)[29]，本次研究結果和美國的研究結果同時顯示沒有發現rpoB基因突變位置與利福平耐藥水平有聯系。美國和意大利分離到的526單密碼子突變株和531單密碼子突變株的利福平平均耐藥水平分別顯著高于本次研究分離到的526單密碼子突變株和531單密碼子突變株[16,29]?？梢妼τ谌毡痉蛛x到利福平MIC值分別為1 μg/mL和0.5 μg/mL的533單密碼子突變株而本次研究卻分離到利福平MIC值為80 μg/mL的533單密碼子突變株是不足為奇的[30]。并且日本研究者發現531突變株的利福平MIC值都≥64 μg/mL，相反，在利福平MIC值≤1 μg/mL的菌株中未發現516,526或531突變株存在[30]。但本次研究中發現65.7%(44/67)的531單密碼子突變株其利福平MIC值都遠低于日本研究者發現的64 μg/mL[30]。另外我們還發現251單密碼子突變株的利福平MIC值范圍為10～80 μg/mL。上述分析顯示，不同地域之間的結核分枝桿菌即使rpoB基因突變位點相同，其利福平耐藥水平也會不同，而同一地域中的菌株即使rpoB基因突變位點不同，其利福平耐藥水平也可能會無顯著性差異，綜上所述，本次研究未發現rpoB基因突變位置與利福平耐藥水平有聯系，而不同地域的菌株可能由于其遺傳背景的差異卻可能導致其利福平耐藥水平不同。

本次研究發現的多重突變株(兩重突變至四重突變)皆由常見突變密碼子516、526、531或533密碼子聯合1至3個其他密碼子突變而來，其平均利福平MIC值為115.8 μg/mL。這些多重密碼子突變株的平均利福平MIC值與單重密碼子突變株的平均利福平MIC值t檢驗分析結果顯示，多重密碼子突變株的平均利福平MIC值顯著高于單重密碼子突變株的平均利福平MIC值(t=2.659，P=0.016)，該結果恰好與美國研究者報道的多重密碼子突變與高水平利福平耐藥有關及其多重突變株利福平MIC值基本≥100 μg/mL的結果相符合[17]。但與國內譚守勇等報道的531密碼子突變以及多重密碼子聯合突變與利福平高水平耐藥有關[31]，以及北京黃海榮等[32]，上海龐茂銀等[33]報道的531突變與利福平高水平耐藥有關存在部分差異。本研究發現的531單密碼子突變株利福平MIC值低于他們所報道的，可能與他們所測序列僅涵蓋rpoB基因RRDR附近區域的核苷酸序列有關。其中譚守勇等所測序列僅為RRDR附近的184 bp[31]，黃海榮所測序列為RRDR附近的588 bp[32]，龐茂銀所測序列為RRDR附近的213 bp[33]，而本研究所測區域為rpoB基因起始密碼子前-370 bp至+1 554 bp內的核苷酸序列(為1 924 bp)，范圍遠大于他們所測序列，因此推測他們所發現的與利福平高水平耐藥有關的531突變株可能不是單密碼子突變株，也許在他們測定區域之外還有其他密碼子突變存在。

總之，本研究結果提示結核分枝桿菌rpoB基因的突變位置可能只與利福平耐藥表型有關而未發現其與利福平耐藥水平有聯系，但多重突變可能導致利福平耐藥水平顯著高于單重突變株，因此rpoB基因的突變位置不能用于預測利福平耐藥水平，但多重突變卻可能是利福平高水平耐藥的標志。另外，rpoB基因起始端單密碼子突變株的發現，提示除RRDR之外將rpoB基因起始端作為第二個靶標用以檢測利福平敏感性有可能提高現有分子診斷技術的準確性。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.009

中圖分類號：R378.91

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0039-06

收稿日期：2015-05-04；修回日期:2015-08-17

Relationship between rpoB mutations and the levels of rifampicin resistance in M. tuberculosis

HU Zu-qiong1,LIU Yan-wen1,ZHOU Wen2,GAO Lu-lu3,CHEN Jun-yu1,XIE Wei-sheng1,ZHOU De-wang1,ZENG Shao-fang1,ZHONG Bing-tang1

(1.StateKeyLaboratoryofRespiratoryDiseases,DepartmentofClinicalLaboratory,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China;2.CentreforDiseaseControlandPreventionofYuexiuDistrict,Guangzhou510513,China;3.LogisticsDepartmentofGuangzhouAirForceMilitaryAreaCommand,Guangzhou510523,China)

Abstract:To learn about the correlation of mutation characterization of rpoB gene and the rifampicin(RIF) resistance levels in M. tuberculosis isolates, the 266 isolates were subjected to DNA sequencing of rpoB genes and to determining their rifampicin MICs, then the rifampicin MICs of isolates with different rpoB mutation profiles were analyzed by t-test. All of the 109 RIF-resistant(RIF-R) isolates had missense mutations in rpoB, but the 157 RIF-susceptible(RIF-S) isolates had not. Codons 531(69.7%) and 526(17.4%) were still the most frequent mutations. The 5.5%(6/109) RIF-R isolates had all mutations only at the beginning of the rpoB (at codon 247, 251 and 253). In addition, the MICs in the 531 single mutants and 526 single mutants showed no significant difference(P=0.87). But the MICs between single mutants and multiple mutants showed statistically significant difference(t=2.659, P=0.016). The 531 and 526 were the most frequent mutation codons in rpoB and the single codon mutation was the major characterization of rpoB in MTB. The significant difference of RIF MICs have not been found between the 531 single mutants and the 526 single mutants, but t-test showed that the RIF MICs of multiple mutants were significantly higher than that of single mutants. Therefore, DNA sequencing of rpoB are helpful for predicting rifampicin resistance phenotype and rifampicin resistance levels in MTB. In addition, mutations identified at the beginning of the rpoB may exhibit another hot-spot region except for RRDR conferring rifampicin resistance in M. tuberculosis.

Keywords:M. tuberculosis; rpoB mutation; rifampicin; resistance level; MICs

廣東省醫學科研基金項目(A2013530)資助