噬菌體TM4、Guo1和D29對靜止期結核菌裂解作用初步研究

柳　巖，江莉莎，姚義勇，曹　俊，郭述良

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噬菌體TM4、Guo1和D29對靜止期結核菌裂解作用初步研究

柳巖，江莉莎，姚義勇，曹俊，郭述良

重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶400016

摘要：目的研究噬菌體TM4、Guo1、D29能否裂解靜止期結核菌。方法采用密閉培養至對數生長期的結核分枝桿菌構建靜止期結核菌模型；采用藥敏檢測、金胺o-尼羅紅熒光染色和電鏡觀察作為檢測模型方法；采用most probable number(MPN)法計數作為裂解作用的檢測指標。結果密閉培養11個月的靜止期結核菌模型構建成功；經不同處理后，MPN計數結果為對照組1100，Guo1組23，TM4組23，D29組600，RFP組673，INH組887；與對照組相比，Guo1組和TM4組菌量明顯減少(P<0.01,P<0.01),D29組菌量減少不明顯(P=0.05)；與RFP組相比，Guo1組和TM4組菌量亦明顯減少(P<0.05,P<0.05)，D29組菌量減少不明顯(P>0.05)；Guo1組和TM4組菌量無差異。結論噬菌體TM4和Guo1能夠裂解靜止期結核菌，噬菌體D29不能裂解靜止期結核菌，噬菌體TM4和Guo1裂解能力無差別。

關鍵詞：噬菌體；靜止期結核菌；裂解；結核病

Supported by the Major Science and Technology Program in the National “12th Five-year” Plan of China(No. 2012ZX10003009) and the National Key Clinical Specialty Foundation(No.2012-649)

結核病(TB)是一個全球性的健康問題。最新的WHO報告顯示，2013年估計900萬人發展為活動性肺結核，150萬人死于TB，其中36萬為HIV陽性患者[1]。全球有近1/3的人群感染結核分枝桿菌(M.tuberculosis， MTB)，而其中僅有10%發展為活動性結核病，大多數轉變為潛伏感染，此時MTB多以靜止狀態存在[2]，因此發現新的藥物或者合并用藥殺滅靜止期結核菌至關重要。

Piuri和Dusthackeer[3-4]等發現尾部卷尺蛋白中含有motif3基序的裂解性分枝桿菌噬菌體能夠能特異性識別、感染休眠的恥垢分枝桿菌，并將其DNA注入休眠菌胞內復制增殖，其他報道也有這樣的研究發現[5-6]。因此本課題研究噬菌體TM4、Guo1及D29對靜止期結核菌的裂解作用，并比較裂解作用的強弱。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑中性羅氏培養基CON I型(珠海貝索公司)；Middlebrook 7H9 Broth、Middlebrook 7H10 Agar、Middlebrook ADC增菌液、Agar(美國BD公司)；Tris-base(Sigma公司)；金胺o(珠海貝索公司)；尼羅紅(Sigma公司)；0.22 μm過濾器(美國Millipore公司)；異煙肼注射液(西南藥業)；利福平膠囊(天圣制藥)。

1.1.2菌株結核菌標準株H37Rv(CMCC93004)重慶市肺科醫院提供，接種于中性羅氏培養基CON I型中培養4～6周，后轉種于7H9 broth中(0.47 g 7H9 broth+0.4 mL 50%甘油+10 mL ADC+90 mL ddH2O+0.1 mmol/L CaCl2)，37 ℃、160 r/min搖床(江蘇金壇中大儀器廠)中震蕩培養10～15 d。TM4噬菌體由美國匹茲堡大學Hatfull教授惠贈，Guo1噬菌體由本室分離，D29噬菌體由中國食品藥品鑒定研究所王國治教授惠贈。

1.2方法

1.2.1靜止期結核菌模型的構建參考文獻方法，略有改動[7]。50 mL試管中加10 mL 7H9Broth,將中性羅氏培養基中的H37Rv轉種于其中，至于37 ℃搖床中培養至OD595達0.4，取一定量菌液研磨均勻，向15 mL試管中加入10 mL 7H9Broth，再加100 μL菌液，最后加入500 μg/mL亞甲藍至終濃度為1.5 μg/mL作為無氧指示劑，蓋上膠塞，封口膠密封試管口，至于37 ℃恒溫箱中靜止培養。

1.2.2檢測靜止期結核菌模型

1.2.2.1耐藥檢測參考文獻方法[7]，略有改動。將異煙肼和利福平均配制為100 μg/mL。向18孔板中的3孔分別加入200 μL缺氧6個月的模型菌液，并向其中兩孔分別加入異煙肼和利福平，另一空加入ddH2O作為空白對照，同時取對數生長期結核菌液作為對照。模型菌和對數期菌均做兩個復孔。藥物作用3 d后，用7H9Broth將原液按10倍梯度稀釋至10-5,分別取各濃度菌液100 μL接種于羅氏培養基中，置于37 ℃溫箱(上海躍進醫療器械廠，中國)中靜止培養，定期觀察。

1.2.2.2金胺o-尼羅紅熒光染色參考文獻[8]方法,分別取培養至對數期結核菌和11個月靜止期結核菌模型各10 μL菌液涂于載玻片上，酒精燈加熱蒸干，加金胺o(10 μg/mL)染色20 min，水洗晾干，脫色劑脫色3～5 min，水洗晾干，尼羅紅(10 μg/mL溶于乙醇中，已過濾除菌)染色15 min，水洗，高錳酸鉀溶液復染1 min，水洗晾干，75%甘油封片。

1.2.2.3透射電鏡參考文獻[9]方法,分別取OD值為0.8的結核菌液和靜止期結核菌模型1 mL加入到1.5 mL EP管中，以10 000 r/min離心15 min,EP管底部將形成細菌團塊，吸凈上清液，沿管壁緩慢加入3%戊二醛固定液1.5 mL，將已加入固定液的EP管置于4 ℃冰箱保存過夜。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液清洗3次，后經1%四氧化鋨固定2 h，常規乙醇和丙酮梯度脫水，環氧樹脂浸透、包埋后切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，H-7500型電鏡(Hitachi公司，日本)觀察，Gatan-780CCD拍照。

1.2.3制備噬菌體液參考文獻[10]方法,采用雙層培養法(下層為7H10，上層為7H9)擴增噬菌體，在37 ℃恒溫箱中培養24 h后，加Phage buffer于平板中，約1 h后收集液體，0.22 μm濾器過濾除菌，測定滴度，Guo1 5.5×1010(phage-forming unit,PFU)/mL,TM4 5.0×1010PFU/mL,D29 3.9×1010PFU/mL。

1.2.4裂解靜止期結核菌取密閉培養11個月的靜止期結核菌入磨菌器中研磨均勻，每支試管中加入2 mL菌液，其中一支加入105 μL ddH20作為對照，其余試管分別加入105 μL Guo1、TM4、D29、RFP(5 μg/mL)、INH(5 μg/mL)。每份共兩個復管，所有試管均置于37 ℃恒溫箱中靜止培養。

1.2.5檢測靜止期結核菌被裂解情況

1.2.5.1菌落計數取加藥后靜止培養第6 d的靜止期結核菌，用離心機(Sigma公司，美國)以4 ℃ 7 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入6%硫酸亞鐵銨洗去未吸附的噬菌體，4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，棄硫酸亞鐵銨溶液，加入ddH2O洗去殘留的硫酸亞鐵銨溶液，4 ℃ 10 000 r/min離心5min，反復清洗2～3次后，加入200 μL 7H9Broth吹打混勻菌塊，用7H9Broth按10倍梯度稀釋原液至10-8，每個稀釋梯度均取500 μL菌液入48孔板，封口膠密封，置于37 ℃恒溫箱中靜止培養15 d，然后采用MPN法進行菌落計數。MPN法為將菌液按10倍梯度系列稀釋，每個稀釋度均有3個孔，若3個孔均有菌落生長則記為3，其中兩孔有菌落生長記為2，以此類推，如3個孔均無菌落生長則記為0，例如稀釋度0.1,0.01,0.001分別對應數值為3,2,1，則對應的MPN值為150，3個復管分別對應的MPN值相加后取平均MPN值。

1.2.5.2刃天青染色參考文獻[11]方法,向靜置15 d后的48孔板中每孔加入75 μL的過濾除菌0.01%刃天青，在37 ℃孵育3 d。

1.2.6統計分析結果采用SPSS19.0(SPSS Inc.,USA)進行統計學處理，組間差異采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2結果

2.1檢測靜止期結核菌模型

2.1.1耐藥檢測結果參考文獻[7]方法,密閉培養的試管內亞甲藍于第25 d變為無色，說明試管內為缺氧狀態。根據文獻，靜止期結核菌的特征為對抗結核藥物耐藥，液體培養基可見菌落但固體培養基不可見菌落，根據藥敏結果(表1)，缺氧6個月模型菌原液管底仍可見到菌落，說明模型菌并未完全進入靜止狀態。

表1　缺氧6個月H37Rv藥敏檢測結果

2.1.2金胺o-尼羅紅染色結果參考文獻[12]方法，金胺o-尼羅紅雙染色能分別將同一標本中的活躍結核菌染成綠色，有脂質聚集的結核菌染成紅色，根據染色結果(圖1)，對數期的結核菌(A)約90%被染為綠色熒光，11個月靜止期結核菌(B)約80%被染為紅色熒光，黃色熒光為綠色和紅色熒光重疊部分，可見靜止期結核菌模型已構建成功。

A:為對數期結核菌；B為培養11個月靜止期結核菌

2.1.3透射電鏡觀察結果取對數生長期和缺氧11個月的H37Rv進行透射電鏡觀察，結果(圖2)，缺氧11個月的H37Rv(B)細胞壁較對數生長期H37Rv(A)明顯增厚，可見靜止期結核菌模型構建成功。

A為對數期的薄壁H37Rv(×60 000)； B為密閉培養11個月的厚壁H37Rv。(×100 000)

2.2靜止期結核菌裂解情況

2.2.1菌落計數結果加藥后靜止培養第6d的菌經處理，15 d后MPN法菌落計數結果(圖3)。與對照組相比，TM4組和Guo1組菌量均明顯減少(P<0.01，P<0.01)，差異有統計學意義,D29組菌量減少并不明顯(P=0.05)，差異無統計學意義；與RFP組相比，TM4組和Guo1組菌量亦明顯減少(P<0.05，P<0.05)，差異有統計學意義，D29組菌量減少并不明顯(P>0.05),差異無統計學意義；TM4組與Guo1組菌量無差別(P=1.00)。由此可知，TM4和Guo1對靜止期結核菌有裂解作用，D29不能裂解靜止期結核菌，TM4和Guo1的裂解能力無差別。

2.2.2刃天青染色結果活細胞中的乳酸脫氫酶能將刃天青(藍色)轉化為熒光物質試鹵靈(粉紅色)，無活性的或死亡的細胞喪失代謝能力而不能還原刃天青[13]。刃天青染色結果如表2。

3討論

目前已成功構建的靜止期結核菌模型有多種，

第一列P值為與對照組相比，第二列P值為與RFP組相比。

表2　刃天青染色后48孔板內顏色

其中，缺氧模型是研究最早，應用最廣泛的模型，因此本實驗采用缺氧模型。根據靜止期結核菌對抗結核藥物耐藥，形態學上的改變及發生脂質聚集，采用藥敏、透射電鏡及熒光雙標記法驗證模型構建成功，本實驗中密閉培養11個月模型菌電鏡下見細胞壁明顯增厚，因靜止期結核菌可發生脂質聚集，應用尼羅紅對模型菌染色，透射電鏡下呈現紅色熒光，對數期結核菌因無脂質聚集，則被金胺o染為綠色熒光，以上均可說明靜止期結核菌模型構建成功。

Pedulla[14]等通過生物信息學分析發現包括TM4在內的一些長尾分枝桿菌噬菌體尾部卷尺蛋白(tape measure protein)含有3種特殊序列，分別命名為基序(motif)1,2和3。motif3[3,14]是一種肽聚糖水解酶基序，具有與復蘇促進因子(Resuscitation promoting factor, Rpf)相似的水解肽聚糖的能力。Rpf可通過水解細胞壁肽聚糖促進靜止期結核菌復蘇[15-19]。有研究發現卷尺蛋白與噬菌體尾部的長度正相關，而卷尺蛋白越長含有motif3基序的可能性越大(一般大于1 000 aa的卷尺蛋白含有motif3基序)。由此推測具有長尾的噬菌體有可能裂解靜止期結核菌[20]。本實驗中選用的噬菌體Guo1和TM4均有較長的尾部，且含有motif3基序，通過與靜止期結核菌作用6 d后進行7H9液體復蘇，然后采用MPN法進行菌量計數，計數結果顯噬菌體TM4組和Guo1組的菌量均為23，與對照組(1100)和RFP組(673)相比，均明顯減少。而噬菌體D29由于其尾部較短，且不含motif3基序[21]，推測其對靜止期結核菌沒有殺滅作用，本實驗也證實了這一點。刃天青染色結果顯示，TM4組和Guo1組在稀釋倍數較低時，仍為藍色，而其余組在稀釋倍數較高時都已變為粉紅色，進一步證明噬菌體TM4和Guo1能夠裂解靜止期結核菌。因此，我們推測噬菌體TM4和Guo1有望成為殺滅靜止期結核菌，減少結核病復發的新手段。

本課題組前期研究發現分枝桿菌噬菌體雞尾酒制劑具有比單一噬菌體更強的殺滅耐藥結核菌的能力；其導致宿主菌耐藥突變率也降低，因此推測噬菌體雞尾酒制劑對靜止期結核菌亦有相同的作用[22]。再者，宿主菌對噬菌體和抗結核藥物有著不同的耐藥機制，因此，噬菌體的治療或者聯合抗結核藥物治療可能會成為一個非常有價值的途徑。但是，噬菌體以多大劑量以及通過何種途徑進入體內，如何在不破壞體內其他成分的前提下有效地殺滅靜止期結核菌等，都需要更進一步的實驗證明。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.007

通訊作者：郭述良，Email:guosl999@sina.com

中圖分類號：R446.5

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0028-05

Corresponding author:Guo Shu-liang, Email: guosl999@sina.com

收稿日期：2015-05-21；修回日期:2015-11-15

Lysis of mycobacteriophages in stationary cells of M.tuberculosis

LIU Yan,JIANG Li-sha,YAO Yi-yong,GUO Shu-liang

(DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Abstract:To investigate the potential of mycobacteriophages TM4, Guo1 and D29 in lysing stationary cells of M. tuberculosis. Stationary cells of M. tuberculosis were induced by prolonged closed culture of logarithmic phase M. tuberculosis at 37 ℃，which were proven through drug sensitivity test, auramine o-Nile red fluorescent staining and electron microscope. The most probable number(MPN) method was used to detect whether the stationary cells of M. tuberculosis had been lysed by TM4,Guo1 and D29. Stationary cells of M. tuberculosis were obtained successfully by closed culture for 11m at 37 ℃. The amounts of M. tuberculosis in control, Guo1, TM4,D29, RFP and INH groups by MPN method were respectively 1 100, 23, 23, 600, 673, 887 after different treatments. Compared with control group, the amount of M. tuberculosis in Guo1 and TM4 groups decreased more obviously(P<0.01, P<0.01) than D29 group(P=0.05), compared with RFP group, the concentration of M. tuberculosis in Guo1 and TM4 groups also reduced more obviously(P<0.05, P<0.05) than D29 group(P>0.05), while there was no significant difference between the amounts of M. tuberculosis in TM4 and Guo1 group. In conclusion, mycobacteriophage TM4 and Guo1 can lyse stationary cells of M. tuberculosis, while D29 can't, the ability of TM4 lysing stationary cells of M. tuberculosis was the same as Guo1.

Keywords:mycobacteriophage; stationary cells of M. tuberculosis; lysis; tuberculosis

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10003009)國家臨床重點專科專項經費資助項目(No.2012-649)資助