檢測特異抗體膠體金免疫層析試條診斷內臟利什曼病患者現場評價

馮曉平，高春花，石　鋒，楊玥濤，汪俊云

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檢測特異抗體膠體金免疫層析試條診斷內臟利什曼病患者現場評價

馮曉平，高春花，石鋒，楊玥濤，汪俊云

中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所，衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室，國家級熱帶病國際聯合研究中心，世界衛生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心，上海200025

摘要：目的在現場評價檢測內臟利什曼病特異抗體的膠體金免疫層析試條診斷內臟利什曼病患者的效果。方法2013年采集動物源型內臟利什曼病流行區(四川省、甘肅省)和人源型內臟利什曼病流行區(新疆喀什市)疾病預防控制中心門診就診的病人血樣和骨髓樣本，用鏡檢法、內臟利什曼病試條和rK39試條進行平行測試，以鏡檢法為金標準，比較兩種試條法檢測的敏感性和特異性有無差異。結果內臟利什曼病試條和rK39試條檢測鏡檢確診的97例內臟利什曼病患者的敏感性分別為98.87%(96/97)，97.94%(95/97)，二者無統計學差異(χ2=0.34，P>0.05)。兩種試條檢測非內臟利什曼病病例145例， 均有2例假陽性反應，特異性為98.62(143/145)。對來自動物源型內臟利什曼病流行區和人源型內臟利什曼病流行區的內臟利什曼病患者分別統計陽性率，結果顯示內臟利什曼病試條和rK39試條法檢測動物源型和人源型流行區的內臟利什曼病患者血樣之間陽性率的差異均無統計學意義(χ2=0.22 /0.01，P>0.05)。兩種試條法檢測動物源型和人源型內臟利什曼病流行區非內臟利什曼病患者血樣之間特異性的差異也均無統計學意義(χ2=0.29，P>0.05)。結論快速檢測內臟利什曼病的膠體金免疫層析試條適用于檢測動物源型內臟利什曼病流行區患者血樣中的特異性抗體。

關鍵詞：內臟利什曼病；免疫層析試條；現場評價

Supported by the National Science & Technology Major Program(Nos. 2012ZX10004-220 and 2012ZX10004-201)

內臟利什曼病(visceral leishmaniasis, VL)或稱黑熱病(kala-azar)，是由杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani) 或嬰兒利什曼原蟲(L.infantum) 寄生于人體的淋巴—巨噬細胞系統所引起的一種寄生蟲病，由媒介白蛉叮咬傳播。內臟利什曼病可分為兩種類型，即人源型(Anthroponotic visceral leishmaniasis , AVL) 和動物源型(Zoonotic visceral leishmaniasis , ZVL)，感染蟲種分別為杜氏利什曼原蟲和嬰兒利什曼原蟲[1]。自1990年以來，我國黑熱病疫情迅速回升，主要分布在新疆、甘肅、四川、陜西、山西和內蒙6省(區)，嚴重威脅著我國西部人民的生命和健康[2]。發展快速而又準確的診斷技術是治療和控制該病傳播的關鍵。近年發展起來的免疫膠體金層析試條技術以其快速、簡便、敏感、特異的顯著優點，特別適合現場應用。 前期本實驗室研制了以利什曼原蟲前鞭毛體可溶性抗原為包被抗原檢測內臟利什曼病特異抗體的快速診斷黑熱病的膠體金免疫層析試條，實驗室評價顯示其檢測的敏感性和特異性均為95%以上[3]。為此，我們對此診斷試劑在現場做進一步評價，報道如下。

1材料和方法

1.1研究對象四川省、甘肅省和新疆喀什市疾病預防控制中心的門診為試驗點。四川省和甘肅省為動物源型內臟利什曼病流行區，新疆喀什市為人源型內臟利什曼病流行區。對前來就診的來自黑熱病流行區疑似黑熱病患者進行骨髓穿刺，取骨髓涂片3張，甲醛固定，吉姆薩染色，同時取靜脈血進行試條測檢測。共檢測了97例鏡檢確診內臟利什曼病病例，其中動物源型內臟利什曼病流行區為69例，人源型黑熱病流行區為28例；對來自非黑熱病流行區無黑熱病暴露史的非黑熱病就診患者取血進行試條檢測，共檢測145例。

1.2鏡檢骨髓涂片分別由上述省、市疾病預防控制中心專家進行鏡檢，本研究組專家進行復核，觀察到利什曼原蟲無鞭毛體判為陽性，每張片至少在油鏡下觀察 2 000 個視野而沒有發現利什曼原蟲無鞭毛體則判為陰性。

1.3內臟利什曼病免疫層析試條的制備和樣本檢測快速檢測內臟利什曼病特異抗體的免疫層析試條為本研究組制備[3]。事先培訓上述門診檢驗人員，按照文獻[3]方法進行測試，即取20 μL全血或10 μL待檢血清滴于試條樣品墊上，吸干后再加1～2滴(約50～100μL)磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution pH7.4，PBS)。質控帶和檢測帶均出現紅色條帶，判為陽性，只有質控帶出現紅色條帶則判為陰性，如果質控帶不出現紅色條帶則說明試條失效。檢測結果均在20 min內判斷。

1.4rK39免疫層析試條rK39免疫層析試條購自美國InBios公司。檢測方法按照操作說明書進行。

1.5統計學分析采用SPSS 11.0 軟件對兩種方法的檢測結果進行χ2檢驗。P<0.05 有統計學意義。

2結果

2.1內臟利什曼病試條法和rK39試條法檢測結果內臟利什曼病試條法和rK39試條法分別檢測鏡檢確診的內臟利什曼病97例，敏感性分別為98.87%(96/97)，97.94%(95/97)；檢測非內臟利什曼病病例145例， 均有2例假陽性反應，特異性為98.62(143/145)(表1)。內臟利什曼病試條法和rK39試條法檢測的敏感性之間差異無統計學意義(χ2=0.34，P>0.05),特異性完全相同(表2)。內臟利什曼病試條法檢測出的96份內臟利什曼病患者血樣中，rK39試條法有1份顯示陰性，二者符合率為98.96%。

表1　兩種試條法檢測內臟利什曼病和非內臟利什曼病患者血樣結果

2.2兩種試條法檢測不同類型內臟利什曼病患者血樣結果比較97例內臟利什曼病患者血樣中69份來自動物源型內臟利什曼病流行區(四川、甘肅)，28份來自人源型內臟利什曼病流行區(新疆喀什市)，分別統計陽性率，結果顯示內臟利什曼病試條和rK39試條法檢測動物源型內臟利什曼病流行區和人源型內臟利什曼病流行區內臟利什曼病患者血樣之間陽性率的差異均無統計學意義(χ2=0.22 /0.01，P>0.05)(表2)。兩種試條分別檢測動物源型內臟利什曼病流行區非內臟利什曼病病例血樣98例，均有1例假陽性；檢測人源型內臟利什曼病流行區非內臟利什曼病病例血樣47例，也均有1例假陽性。兩種試條法檢測動物源型內臟利什曼病流行區和人源型內臟利什曼病流行區非內臟利什曼病患者血樣之間特異性的差異均無統計學意義(χ2=0.29，P>0.05)。

表2　兩種試條法檢測不同類型流行區內臟利什曼病患者血樣結果

3討論

免疫層析試條法是一種快速診斷方法,它將免疫分子親和原理和免疫印跡法、經典的薄層層析技術相結合。由于其敏感性高、操作簡便、損傷性低和報告結果快速而被廣泛應用于疾病的診斷[4]。rK39免疫層析試條應用k39抗原(在所有親內臟利什曼原蟲均保守重復氨基酸序列，此抗原僅在疾病活動期表達)作為包被抗原檢測利什曼原蟲特異抗體，顯示很好的檢測敏感性和特異性，受到廣泛應用[10-11]，有研究者用該試條對我國內臟利什曼病的診斷價值也進行了評價，在現場應用中取得較好的效果，而且可用于低發病率流行區的內臟利什曼病的診斷和篩選[5-9]。由于k39抗原僅在疾病活動期表達，因此，此產品在監測和流行病學調查中的應用受到局限，且該試條價格昂貴，而內臟利什曼病多發于我國西部貧困地區，患者家庭很難承擔，也限制了該試條在現場流行病學調查中的應用。因此，亟待開發我國自己的內臟利什曼病免疫診斷試劑盒。

本課題組研制的檢測內臟利什曼病的免疫層析試條應用親內臟利什曼原蟲前鞭毛體粗抗原作為包被抗原檢測利什曼原蟲特異抗體，理論上應有更好的檢測敏感性，本次現場檢測內臟利什曼病患者血樣的敏感性達到98.97%(96/97)，顯示了很好的檢測敏感性。檢測流行區的非內臟利什曼病病例血樣和正常人血樣也表現出很好的特異性，為98.62(143/145)，與平行檢測的rK39試條檢測的特異性無差異，且對源自動物源型內臟利什曼病流行區和人源型內臟利什曼病流行區患者血樣的檢測結果之間的差異無統計學意義。

現場研究表明，本研究組研制的膠體金免疫層析試條用于內臟利什曼病診斷具有較高的敏感性，操作人員不需要特殊的專業知識和技術培訓，因此具有廣泛的適用性，尤其適用于基層醫療衛生機構。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.006

通訊作者：高春花，Email: gaochunhua1976@aliyun.com

中圖分類號：R531.6

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0024-04

Corresponding author:Gao Chun-hua, Email: gaochunhua1976@aliyun.com

收稿日期：2015-06-25；修回日期:2015-11-12

Evaluation of colloid gold labeled immunochromatographic strip test for rapid detection of canine Leishmanial infection in China

FENG Xiao-ping,GAO Chun-hua,SHI Feng,YANG Yue-tao,WANG Jun-yun

(NationalInstituteofParasiticDiseases,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/LaboratoryofParasiteandVectorBiology,MinistryofHealth/NationalCenterforInternationalResearchonTropicalDiseases,WHOCollaboratingCentreforMalaria,SchistosomiasisandFilariasis,Shanghai200025,China)

Abstract:We evaluated a colloid gold immunochromatographic strip test(ICT) developed by our laboratory for detection of human visceral leishmaniasis in field. The human blood and bone marrow samples from the zoonotic visceral leishmaniasis endemic areas(Sichun and Gansu provinces) and a anthroponotic visceral leishmaniasis endemic area(Kashi, Xinjiang) of suspected visceral leishmaniasis were collected and subjected to be detected by the microscopy, ICT and rK39. Detection results of the ICT were compared with that of the rK39 and then compared with microscopy findings(taken as a golden standard). It was found that the positive detection rates of ICT and rK39 were 98.87%(96/97) and 97.94%(95/97), respectively. There was no statistical difference in the sensitivity between ICT and rK39(χ2=0.34, P>0.05). Detection on 145 blood samples of patients with non-visceral leishmaniasis showed both specificities of 98.62(143/145) by the ICT and rK39. There was no statistical difference in the sensitivity between samples from the zoonotic visceral leishmaniasis endemic areas and the anthroponotic visceral leishmaniasis endemic area by the ICT(χ2=0.22, P>0.05). It is evident that the ICT for detection the leishmanial specific antibody of human peripheral blood specimens is proved to be a reliable method.

Keywords:visceral leishmaniasis; immunochromatographic strip; field evaluation

國家科技重大專項(No.2012ZX10004-220和2012ZX10004-201)