環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在嗜水氣單胞菌檢測中的應(yīng)用

孟　雙，王　毅，王　艷，葉長蕓

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環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在嗜水氣單胞菌檢測中的應(yīng)用

孟雙，王毅，王艷，葉長蕓

中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206

摘要：目的建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)對嗜水氣單胞菌檢測的方法，并用臨床標(biāo)本對該方法進(jìn)行評價(jià)。方法根據(jù)嗜水氣單胞菌desA 基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用參考質(zhì)粒評價(jià)該檢測體系的靈敏度；用30種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌評價(jià)該檢測體系的特異性；用糞便模擬樣本以及臨床樣本評價(jià)該檢測體系的臨床檢測的可行性。結(jié)果LAMP檢測體系對嗜水氣單胞菌重組質(zhì)粒的檢測靈敏度為1×102拷貝/反應(yīng)體系；LAMP檢測體系在檢測30種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌時(shí)未出現(xiàn)假陽性；LAMP檢測體系在糞便模擬標(biāo)本中的檢測下限為5 × 103 CFU/g；通過與qPCR技術(shù)相比較，LAMP具有更高的靈敏度以及更優(yōu)秀的臨床標(biāo)本的檢測能力。結(jié)論本研究建立的LAMP方法是首次將LAMP技術(shù)運(yùn)用到了嗜水氣單胞菌的檢測，所需儀器設(shè)備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨床檢驗(yàn)和基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：嗜水氣單胞菌；LAMP；qPCR

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Diseases(No. 2013ZX10004-101)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種革蘭陰性、能運(yùn)動(dòng)、兼性厭氧、氧化酶陽性的桿狀細(xì)菌，屬于弧菌科、氣單胞菌屬[1]。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，是典型的人-獸-魚共患病的病原菌。近年來大量研究表明，嗜水氣單胞可單獨(dú)或者與其他致病菌共同感染，引起人類腸胃炎、敗血癥以及外傷引起軟組織感染等病癥[2]，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的條件致病菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義[3-4]。

目前對于嗜水氣單胞菌的檢測方法主要有分離培養(yǎng)、普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR(qPCR)等分子生物學(xué)方法。分離培養(yǎng)方法操作步驟繁瑣，檢測周期長，一般需要3～5 d完成，不能滿足快速檢測的需求[5]。最近幾年，PCR和qPCR分子生物學(xué)檢測方法在病原菌檢測中的應(yīng)用越來越廣[6-7]，但這些方法的檢測成本高，需要精密昂貴的熱循環(huán)儀器，且對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者的技術(shù)也有嚴(yán)格的要求，因此限制了該技術(shù)的普遍適用性，不利于在農(nóng)村地區(qū)以及基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等建立的一種新的核酸擴(kuò)增方法[8]。其原理是利用4條特殊設(shè)計(jì)的引物及具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速的擴(kuò)增DNA，可以在1 h之內(nèi)使產(chǎn)物的量達(dá)到109個(gè)拷貝。最近幾年，LAMP以其靈敏度高、特異性好、反應(yīng)速度快和操作簡單等特點(diǎn)在各種病原菌檢測中的應(yīng)用越來越廣[9]。本研究的目標(biāo)是建立一種嗜水氣單胞菌的快速、可靠的LAMP技術(shù)，并使用糞便模擬標(biāo)本和實(shí)際臨床樣本對該技術(shù)的檢測能力進(jìn)行評價(jià)，以期將該項(xiàng)技術(shù)在基層實(shí)驗(yàn)室及農(nóng)村地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模的推廣使用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國藥品生物制品檢定所，其他菌株分離自食品、糞便和嘔吐物等樣品，均經(jīng)德靈WALKAWAY-40SI全自動(dòng)微生物分析儀鑒定。用于特異性評價(jià)的菌株見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)用菌株

1.1.2試劑與儀器設(shè)備Loopamp Kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)購自日本榮研公司。Premix Ex TaqTM、Easy Dilution、pMD18-T載體、JM109 感受態(tài)細(xì)胞、Ex Taq DNA聚合酶以及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自Promega公司。Loopamp實(shí)時(shí)濁度儀LA-320(Eiken Chemical Co., Ltd, Japan)購于日本榮研公司。ABI 7900Fsat 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌基因組DNA的提取細(xì)菌基因組DNA的提取使用TAKARA公司的MiniBEST試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。利用紫外分光光度計(jì)測定細(xì)菌基因組DNA的純度和濃度，嗜水氣單胞菌基因組DNA用EasyDilution緩沖液稀釋至5×105～ 5×10-3pg/μL的濃度梯度，陰性對照用EasyDilution緩沖液稀釋至5×104pg/μL，各種基因組DNA均少量分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LAMP引物的設(shè)計(jì)及LAMP反應(yīng)體系的建立 根據(jù)嗜水氣單胞菌特異性基因desA設(shè)計(jì)交叉反應(yīng)引物。我們利用多序列比對軟件ClustalX 1.83對嗜水氣單胞菌的參考菌株進(jìn)行desA基因的序列比對，在該基因的保守區(qū)域使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4 software(http://primerexplorer.jp)(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)在線進(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，并將設(shè)計(jì)的引物在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配。引物設(shè)計(jì)的位置和方向見圖1，序列見表2。LAMP的反應(yīng)體系如下：引物F3和B3的濃度為5 pmol，引物FIP和BIP的濃度為40 pmol，引物L(fēng)F和LB的濃度為20 pmol，Betain的濃度為2.5 mol/L，MgSO4的濃度為150 mmol/L，dNTP的濃度為10 mmol/L，BstDNA polymerase 的濃度為8 U，模板為2 μL，補(bǔ)加去離子水至25 μL。整個(gè)反應(yīng)在LA320實(shí)時(shí)濁度儀中進(jìn)行，等溫?cái)U(kuò)增65 ℃1 h，80 ℃5 min終止反應(yīng)。由于擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段混合物，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過凝膠電泳進(jìn)行檢測；LAMP在合成DNA的同時(shí)還產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子結(jié)合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，擴(kuò)增產(chǎn)物也可以通過濁度進(jìn)行檢測。

1.2.3評價(jià)LAMP檢測技術(shù)的靈敏度和特異性 含desA基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與制備 ①使用desA特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到目的片段；②切膠回收，純化PCR 產(chǎn)物；③連接到T載體；④轉(zhuǎn)化JM109 感受態(tài)細(xì)胞；⑤篩選陽性克隆子，用PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，最終測序確認(rèn)；⑥提取質(zhì)粒，根據(jù)質(zhì)粒的分子量將質(zhì)粒樣品濃度換算為拷貝數(shù)濃度：每μL樣品中檢測基因的拷貝數(shù)=濃度(ng/μL)×阿佛加德羅常數(shù)×10-9/(660×重組質(zhì)粒堿基數(shù))；⑦用Easy Dilution將上述質(zhì)粒依次稀釋成1.0×100拷貝/μL～1.0×106拷貝/μL，共7個(gè)濃度梯度。

1.2.3.1LAMP檢測的靈敏度評價(jià)取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品加入每反應(yīng)體系100拷貝至106拷貝為模板，每個(gè)濃度進(jìn)行3次重復(fù)，評價(jià)LAMP檢測體系的靈敏度。

1.2.3.2LAMP檢測的特異性評價(jià)以常見致病菌及條件致病菌DNA(見表1)為模板評價(jià)LAMP體系的特異性。

1.2.4LAMP與qPCR技術(shù)檢測能力比較qPCR技術(shù)對嗜水氣單胞菌的檢測(本科室建立)所用的引物探針見表1。qPCR的反應(yīng)總體系為20 μL，含2×Premix(TaKaRa) Ex TaqTM 10 μL、10 μmol/ L的引物探針各0. 4 μL、DNA 模板1 μL，補(bǔ)加去離子水至20 μL。在ABI 7900實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上擴(kuò)增并測定結(jié)果，PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數(shù)據(jù)，確定各樣本的Ct(cycle threshold) 值。通過靈敏度、特異性這兩方面對這兩種檢測技術(shù)進(jìn)行比較。LAMP技術(shù)的反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)如上所述。

1.2.5評價(jià)LAMP技術(shù)在糞便模擬樣本中的應(yīng)用①嗜水氣單胞菌(ATCC7966)搖菌至對數(shù)生長期。②用磷酸鹽緩沖液將該菌培養(yǎng)物進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。③取健康人新鮮糞便0.2 g/管，分別加入100 μL不同濃度的嗜水氣單胞菌稀釋懸液，制成5×101～ 5×106CFU/g 梯度濃度的糞便模擬標(biāo)本。④應(yīng)用QIAamp DNA stool mini kit(QIAGEN, Venlo, Netherlands)試劑盒抽提所有糞便標(biāo)本，每個(gè)菌濃度進(jìn)行3次重復(fù)，平行獨(dú)立提取DNA進(jìn)行qPCR和LAMP檢測。

1.2.660份臨床樣本的檢測60份腹瀉病人的糞便標(biāo)本分別進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定、qPCR和LAMP檢測。培養(yǎng)分離方法的操作步驟如下。首先標(biāo)本使用堿性蛋白胨水(APW, pH 8.5)進(jìn)行增菌過夜培養(yǎng)，然后取適量接種于嗜水氣單胞菌的選擇性培養(yǎng)基(Ryan, OXOID, 英國)。該培養(yǎng)基在30 ℃～35 ℃孵育18 h后，挑選疑似嗜水氣單胞的菌落(青綠色，菌落中心為不透明的深綠色)進(jìn)行生化鑒定。接著將初步鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株進(jìn)行管家基因rpoD的擴(kuò)增和測序，將測序結(jié)果在GenBank上用Blast進(jìn)行比對，最后對嗜水氣單胞菌株進(jìn)行確認(rèn)。LAMP和qPCR的檢測體系如前所述。將適量的堿性蛋白胨水增菌液使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA minikits; Qiagen, Hilden, 德國)提取核酸后，吸取2 μL作為qPCR和LAMP的模板。

表2　實(shí)驗(yàn)中所用引物

2結(jié)果

2.1目的基因片段的克隆實(shí)驗(yàn)獲得的desA擴(kuò)增片段分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致，將所得片段連接到T載體轉(zhuǎn)化受體菌獲得克隆子中，經(jīng)測序驗(yàn)證，所獲陽性克隆包含的目的片段序列完全正確。

2.2LAMP檢測體系的靈敏度LAMP和qPCR針對desA基因的檢測下限分別為20 拷貝每反應(yīng)體系(Fig.2A)和200 拷貝每反應(yīng)體系，顯示LAMP在檢測嗜水氣單胞菌DNA時(shí)比qPCR方法更靈敏。LMAP的擴(kuò)增結(jié)果可以用電泳方法來檢測(Fig. 2B)，也可以通過加入Loopamp熒光染料(FD)通過肉眼觀察顏色的改變來檢測(Fig.2C)。當(dāng)存在陽性擴(kuò)增時(shí)，F(xiàn)D染料的桔色快速變?yōu)榫G色，在黑色背景下更為顯著；當(dāng)擴(kuò)增為陰性時(shí)，管內(nèi)顏色維持桔黃色不變。

2.3LAMP檢測方法的特異性評價(jià)30株嗜水氣單胞菌核酸檢測均在1 h內(nèi)出現(xiàn)了陽性擴(kuò)增，33株非嗜水氣單胞菌核酸檢測都未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明該LAMP檢測技術(shù)的特異性好。

2.4LAMP檢測技術(shù)在糞便模擬樣本中的應(yīng)用LAMP檢測技術(shù)在糞便模擬標(biāo)本中的檢測下限為5×103CFU/g，相比之下，qPCR針對desA基因在糞便模擬標(biāo)本中的檢測下限為5×104CFU/g，說明LAMP比qPCR對糞便模擬標(biāo)本的檢測更靈敏。

2.5LAMP檢測技術(shù)在臨床標(biāo)本中的應(yīng)用結(jié)果發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)能檢測出嗜水氣單胞菌陽性標(biāo)本9份，而qPCR技術(shù)只能檢測出嗜水氣單胞菌陽性標(biāo)本7份，并且LAMP的檢測結(jié)果與分離培養(yǎng)方法相一致(見表3)，說明LAMP技術(shù)對臨床標(biāo)本的檢測能力優(yōu)于qPCR。因此LAMP檢測可作為一種快速的嗜水氣單胞菌的篩查方法在基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場處理疫情時(shí)進(jìn)行推廣使用。

3討論

(A)通過檢測產(chǎn)物的濁度變化來評價(jià)LAMP檢測的靈敏度。1-6:質(zhì)粒模板濃度分別為2.0×107～1.0×102 拷貝每反應(yīng)體系，檢測下限為20 拷貝每反應(yīng)體系。(B) 通過瓊脂糖凝膠電泳來評價(jià)LAMP檢測的靈敏度。1-8:質(zhì)粒模板濃度分別為2.0×107～1.0×100 拷貝每反應(yīng)體系，檢測下限為20 拷貝每反應(yīng)體系。(C) LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過加入FD熒光染料來檢測。發(fā)生陽性擴(kuò)增時(shí)，產(chǎn)物的顏色由最初的橙黃色變?yōu)榫G色；而陰性擴(kuò)增的顏色則不會(huì)發(fā)生改變。

表3　LAMP技術(shù)在臨床樣本檢測中的應(yīng)用

近幾年來，嗜水氣單胞菌作為一種突發(fā)的食源性疾病受到越來越多的重視。來自西班牙國家傳染病預(yù)防控制中心的數(shù)據(jù)表明在1997-2006年間所有引起胃腸疾病的細(xì)菌中，嗜水氣單胞菌位居第四位[10]。2014年印度研究者[11]報(bào)道了1例嗜水氣單胞菌感染引起壞死性筋膜炎導(dǎo)致患者死亡的病例，受到了國內(nèi)外的高度重視。隨著嗜水氣單胞菌誘發(fā)病例的增多，環(huán)境保護(hù)署(EPA)已經(jīng)將該菌列入潛在的水傳播病原菌的候選名單[12]。因此，為了給予臨床病人準(zhǔn)確快速的治療和嗜水氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查，研發(fā)一個(gè)操作簡單、靈敏度高和特異性好的嗜水氣單胞菌檢測方法成為必要。

雖然嗜水氣單胞菌誘發(fā)腸胃炎的致病機(jī)理并未完全闡明，但研究者已經(jīng)對一些潛在的毒力因子進(jìn)行了深入的研究。攝取鐵離子與一些病原菌的毒力密切相關(guān)，人體中的亞鐵血紅素是病原菌鐵離子的一個(gè)重要來源，并且許多病原菌本身就具有亞鐵血紅素運(yùn)輸系統(tǒng)，desA基因是編碼嗜水氣單胞菌亞鐵血紅素鐵離子利用系統(tǒng)的重要基因之一[13]，并且編碼一種外膜蛋白受體，可以從環(huán)境中攝取細(xì)菌生長和存活所必需的鐵離子，因此是一個(gè)理想的檢測目的基因。

傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)和生化鑒定方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前常用的嗜水氣單胞菌商品化檢測系統(tǒng)(API和Vitek, bioMérieux)能夠進(jìn)行屬水平的鑒定，通常需要24 h，但該過程卻忽略了對溫度和培養(yǎng)基有明顯依賴的脫羧酶和水解酶反應(yīng)，在將嗜水氣單胞菌與其他密切相近的菌種進(jìn)行區(qū)分時(shí)出現(xiàn)了困難[5,14]。PCR技術(shù)和qPCR技術(shù)的檢測成本高，需要精密昂貴的熱循環(huán)儀器，且對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作者的技術(shù)也有嚴(yán)格的要求，因此限制了該技術(shù)的普遍適用性，不利于基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。相比之下，LAMP檢測技術(shù)則具有很多的優(yōu)勢：1)LAMP對靶序列擴(kuò)增效率高，體系中其他共存非靶DNA對其擴(kuò)增的影響較小。LAMP的檢測下限為幾個(gè)拷貝，靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通PCR技術(shù)，有研究者證實(shí)LAMP的靈敏度等于甚至高于qPCR的檢測靈敏度。2) 產(chǎn)物檢測方便、快捷。因?yàn)長AMP在合成各種莖環(huán)DNA的同時(shí)還產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物—焦磷酸鹽，并且生成白色的焦磷酸鎂沉淀物。Mori等[8-9]利用這些特性來檢測LAMP產(chǎn)物，可以直接根據(jù)沉淀的形成來定性的判斷擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生，還可以通過檢測其產(chǎn)物濁度的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測。3) LAMP對靶序列擴(kuò)增的特異性高。由于LAMP通過4條引物與靶序列上的6個(gè)特異部位準(zhǔn)確結(jié)合來產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)，因此可以獲得比PCR更高的特異性。4) 設(shè)備要求簡單，易操作。LAMP反應(yīng)只需要一個(gè)普通的水浴鍋或者恒溫裝置，不需要昂貴的PCR儀。5) 反應(yīng)速度快。LAMP是恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，沒有PCR反應(yīng)中溫度變化的耗時(shí)，一般在30 min～60 min內(nèi)即可完成，比普通PCR和qPCR反應(yīng)速度更快，能更好的滿足臨床快速檢測的要求。另外，在LAMP反應(yīng)體系中增加2條環(huán)引物可使反應(yīng)所需時(shí)間比原來縮短一半，整個(gè)反應(yīng)可以在40 min內(nèi)完成，大大提高了檢測效率。這些特性使得LAMP技術(shù)更適用于在基層實(shí)驗(yàn)室及現(xiàn)場處理疫情時(shí)使用。

本研究首次使用了LAMP技術(shù)對嗜水氣單胞菌進(jìn)行了檢測。LAMP檢測體系對嗜水氣單胞菌重組質(zhì)粒的檢測靈敏度為1×102拷貝每反應(yīng)體系，并在檢測30種其他腸道致病菌及院內(nèi)感染中常見的致病菌時(shí)未出現(xiàn)假陽性；LAMP檢測體系在糞便模擬標(biāo)本中的檢測下限為5×103CFU/g，在60份臨床標(biāo)本中檢出嗜水氣單胞菌陽性標(biāo)本9份，該檢測結(jié)果與分離培養(yǎng)結(jié)果相一致。通過對LAMP檢測技術(shù)和qPCR檢測技術(shù)進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)LAMP技術(shù)無論在檢測靈敏度上還是在檢測速度上都優(yōu)于qPCR。一般情況下，以分子水平為基礎(chǔ)的檢測方法例如PCR和qPCR都會(huì)受臨床標(biāo)本中抑制物的影響，一些研究者報(bào)道LAMP使用的BstDNA聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要強(qiáng)[15]，因此，LAMP比qPCR具有更廣闊的臨床應(yīng)用前景。

總之，本研究建立的LAMP方法是首次將LAMP技術(shù)運(yùn)用到了嗜水氣單胞菌的檢測，該方法在1 h內(nèi)就可以觀察結(jié)果，滿足了臨床快速診斷的需要，并且該方法對臨床樣本的靈敏度高于qPCR法，反應(yīng)時(shí)間更快，所需儀器設(shè)備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨床檢驗(yàn)、檢疫及基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行推廣應(yīng)用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.001

通訊作者：葉長蕓，Email：yechangyun@icdc.cn

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0001-06

Corresponding author:Ye Chang-yun, Email:yechangyun@icdc.cn

收稿日期：2015-06-19；修回日期:2015-07-24

Loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Aeromonas hydrophila

MENG Shuang,WANG Yi,WANG Yan,YE Chang-yun

(StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterofDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay for the detection of Aeromonas hydrophila, a set of 6 primers targeted toward the desA gene of the A. hydrophila was designed using PrimerExplorer V4 software(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) based on the conserved sequences. The performance of the assay with reference plasmids, simulated human stools, and clinical specimens were evaluated and compared with quantitative PCR(qPCR). No false-positive results were observed for the 33 non-A. hydrophila strains used to evaluate assay specificity. The sensitivity of the LAMP assay was approximately 20 copies per reaction in reference plasmids and 5×103 CFU per gram in spiked human stool, which were more sensitive than the results of qPCR. The performance of the LAMP assay was evaluated with clinical specimens, which had the better detection ability than qPCR. In conclusion, the LAMP assay developed in this study is a valuable method for rapid, cost-effective, and simple detection of A. hydrophila in basic clinical and field laboratories.

Keywords:Aeromonas hydrophila; loop-mediated isothermal amplification; qPCR

國家重大傳染病防治科技重大專項(xiàng)(2013ZX10004-101)資助