嵌合型TCR分子的表達與組裝效率分析

蘇暢，劉婷，黃幗蓉，陳楚如，向靜，徐暢，張文峰，沈晗，邵紅偉

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嵌合型TCR分子的表達與組裝效率分析

蘇暢，劉婷，黃幗蓉，陳楚如，向靜，徐暢，張文峰，沈晗，邵紅偉

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院/生物制藥研究所/廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東廣州510006）

摘要：目的通過對外源TCR分子結構域的定向改造，對嵌合型TCR雙鏈分子的表達與組裝情況進行研究，探討其對TCR基因修飾T細胞（TCR-T）內外源TCR分子與內源TCR分子錯配減少的貢獻，為改善TCR基因修飾的T細胞過繼性免疫治療奠定基礎。方法將結構域未改造的野生型TCR分子、恒定區結構域經過改造的嵌合TCR（chim-TCR）分子及雜合TCR分子轉染7402細胞，通過報告基因的表達分析TCR分子的表達情況，利用熒光共振能量轉移（FRET）技術計算不同的TCR分子組合在細胞中的組裝效率。結果TCR分子經過結構域定向改造后，能夠在細胞內有效地表達和組裝。熒光共振能量轉移（FRET）分析表明嵌合型TCR與野生型TCR分子之間形成的雜合分子FRET值明顯小于嵌合型或野生型自身配對的FRET值。結論結構域定向改造的嵌合型TCRα、β鏈與野生型α、β雙鏈能有效得到表達及組裝，并且嵌合型TCRα、β鏈與野生型α、β鏈組裝配對的效率顯著降低，這為改善基因修飾的T細胞過繼性免疫治療奠定了基礎。

關鍵詞：嵌合型TCR；表達；組裝；熒光共振能量轉移技術

網絡出版時間：2016-04-26 10：38 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160426.1038.001.html

T淋巴細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤免疫的重要組成部分，將具有抗原特異性的T淋巴細胞輸入病人體內的方法——過繼性T細胞療法，對于腫瘤的治療具有良好的應用前景。利用抗原特異性TCR基因修飾T細胞（TCR-T）進行過繼性移植/回輸，已經成為腫瘤生物治療中的一個熱點［1-4］。但在基因修飾的T細胞中，導入的外源TCR分子有可能同內源TCR鏈發生錯配而導致雜合TCR分子的產生［5-6］，這種錯配既會導致自身免疫反應，又導致外源TCR分子有效表達水平的下降。因此，減少內外源TCR分子的錯配是此類研究亟待解決的問題。利用與TCR分子同屬于免疫球蛋白超家族的抗體重鏈和輕鏈的恒定區結構域分別替換其β鏈和α鏈的恒定區結構域，形成了一種嵌合型的TCR分子（chim-TCR）。這種形式的改造首先要討論其表達和配對組裝能力才可以為接下來的功能分析作準備。所以，為了方便對嵌合TCR分子的表達進行檢測，同時利用熒光共振能量轉移技術（fluorescence resonance energy transfer，FRET）計算結構域定向改造的TCRα、β鏈的組裝效率，本實驗分別利用青色熒光蛋白（CFP）對α基因進行了標記，用黃色熒光蛋白（YFP）對β基因進行了標記。

1 材料與方法

1.1 材料

BEL-7402細胞、質粒pDC315-β′YFP、pDC315-α′CFP、pDC315 β′YFP-IRES-α′CFP（β′/α′為改造后的嵌合TCR雙鏈）、pDC315 βYFP-IRES-α′CFP、pIRES-βYFP-αCFP由本實驗室購建、保存；E.coli DH5α菌株購自TAKARA公司；1640低糖培養基購自Invitrogen公司；X-tremeGENE HP購自Roche公司。

1.2 質粒pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP表達分析

BEL-7402細胞接種于6孔板中（1×106cells/ well），待匯合度為80%時按照X-treme GENE HP轉染試劑說明書進行質粒 pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP的轉染，轉染后24 h用熒光顯微鏡觀chimTCR表達情況。

1.3 chimTCR兩條鏈的組裝情況分析

如圖1A所示方式對野生型TCR的恒定區結構域進行改造，改造的TCR修飾T細胞會出現4種類型的TCR分子，其中2種為雜合TCR，本次實驗選取其中1種β/α′類型的雜合TCR作為對照進行FRET分析（圖1B）。在實驗中將2個對照組質粒pDC315-β′YFP、pDC315-α′CFP，3個實驗組質粒pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP（圖1B chim-TCR）、pDC315-βYFPIRES-α′CFP（圖1B hybrid TCR）、pIRES-βYFP-αCFP（圖1B wild type TCR），分別轉染BEL-7402細胞，轉染48 h后，利用Olympus FluoView FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡對各組細胞進行基于 Sensitized Emmission（SE）方法的FRET檢測，在計算組裝效率時，2個對照組的單熒光質粒用于消除光串擾影響。通過比較3種TCR分子組合之間的FRET效率，分析其相互組織配對情況（圖1）。

1.4 統計分析

由于在同一個細胞的細胞膜不同部位，2種熒光蛋白的相互作用是有差異的，如果只選取細胞膜的一處區域會有失偏頗，而全面采集細胞膜上的FRET值則會由于細胞的形狀和結構的差異而產生較大的誤差。所以，在每組實驗中選取8個陽性轉染細胞，進行足夠放大觀察、取圖，然后利用分析軟件FV10-ASW 2.0在陽性轉染細胞的細胞膜部位隨機選取3個區域進行FRET效率分析。采用SPSS分析軟件，實驗數據以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

A.嵌合型TCR分子的改造示意圖；B.實驗組3種質粒示意圖。圖1 TCR結構域改造模式圖及3種TCR分子組合示意圖Figure 1 Schematic diagrams of the construction of chim-TCR and three types of TCRs

2 結果

2.1 質粒pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP表達分析

將質粒pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP轉染BEL-7402細胞48 h后用熒光顯微鏡觀察黃色熒光蛋白（enhanced yellow fluorescence protein，EYFP）與青色熒光蛋白 （enhanced cyanfluorescenceprotein，ECFP）的表達情況，結果如圖2所示，在同一細胞、同一視野內兩種熒光蛋白均有表達，證明質粒pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP已轉染進7402細胞并且成功表達。

圖2　質粒pDC315-β′YFP-α′CFP的表達Figure 2 Expression of plasmid pDC315-β′YFP-α′CFP

2.2 chimTCR兩條鏈的組裝情況分析

將 3種質粒 pIRES-βYFP-αCFP、pDC315-β′ YFP-IRES-α′CFP、pDC315-βYFP-IRES-α′CFP分別轉染7402腫瘤細胞，48 h后用激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，其中CFP通道是受458 nm波長所激發，YFP通道受515 nm波長所激發，能量轉移的YFP通道受458 nm波長激發；FRET效率平面圖中，顏色越偏向紅白色則表明效率越高，越偏向藍黑色則表明效率越低；FRET效率光密度分布立體圖中，縱軸越高則表明效率越高，反之效率越低。結果顯示（圖3），野生型TCR分子之間的FRET效率最高，嵌合型TCR分子之間的FRET效率次之，而野生型和嵌合型分子之間的FRET效率最低，表明結構域改造后的TCR分子與野生型TCR分子之間的配對組裝效率受到了抑制。

2.3 FRET效率

結果見表1，質粒pIRES-βYFP-αCFP轉染后的FRET效率最高，pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP質粒次之，而pDC315-βYFP-IRES-α′CFP轉染后的FRET效率最低且與pIRES-βYFP-αCFP的FRET效率差異有統計學意義，因此可以推測結構域定向改造的α、β鏈與野生型TCR分子發生錯配的幾率明顯降低。

A.pIRES-βYFP-αCFP（野生型TCR）；B.pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP（嵌合型TCR）；C.pDC315-βYFP-IRES-α′CFP（雜合型TCR）。圖3 3種TCR分子的FRET效率分析Figure 3 Analysis of FRET efficiency of three types of TCRs

表1 各質粒轉染7402腫瘤細胞后的FRET效率Table 1 FRET efficiency after plasmid transfection in 7402 tumor cells

3 討論

轉有外源TCR基因的T細胞至少表達2種α鏈和2種β鏈，內源性α鏈和β鏈組成的TCR分子是T細胞本身具有的，具有自身抗原耐受性。外源性α鏈和β鏈組成的TCR分子其抗原識別特異性已明確，但是內源性α鏈與外源性β鏈或內源性β鏈與外源性α鏈也有可能錯配而組成新的雜合TCR分子。國外有研究者通過抗體染色等方法表明TCR基因修飾的T細胞中存在雜合TCR分子［7-8］，我們之前的研究也表明了雜合TCR分子的存在［9］，這種錯配導致的雜合TCR分子由于其抗原識別表位是未知的，因此存在著識別自身抗原，導致患者發生自身免疫性疾病的可能［10-12］。

之前本實驗室已經制備了嵌合型的TCR基因，并構建了不同的雙表達載體，在本研究中，3種質粒pIRES-βYFP-αCFP、pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP、pDC315-βYFP-IRES-α′CFP被分別轉染7402腫瘤細胞，利用FRET技術計算不同TCR分子組合在細胞中的組裝效率。結果顯示，pDC315-βYFP-IRES-α′CFP 的FRET值為0.041±0.16，比質粒pDC315-β′YFPIRES-α′CFP的FRET值低0.017，表明結構域定向改造的TCR分子與野生型TCR分子進行配對組裝的效率明顯降低。而圖3中的FRET效率也是與表1的趨勢相對應的，從FRET立體圖的縱向高度對比，總體從高至低分別是，質粒pIRES-βYFP-αCFP＞pDC315-β′YFP-IRES-α′CFP＞pDC315-βYFP-IRES-α′CFP。

本研究初步表明了結構域定向改造的TCR分子α、β鏈能在胞內正常表達和組裝，且結構域定向改造的TCR α、β鏈與野生型TCR鏈發生錯配的幾率明顯降低。為下一步在淋巴細胞中研究定向改造的TCR分子α、β鏈與細胞內源性TCR分子的錯配情況奠定了基礎。

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（責任編輯：幸建華）

中圖分類號：R392.11

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0362-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011102

收稿日期：2016-01-11

基金項目：國家自然科學基金項目（31100664，31300737，31400149）；廣東省自然科學基金項目（2014A030313586）

作者簡介：蘇暢（1990—），男，2013級碩士研究生，Email：changsu8000@163.com；通信作者：邵紅偉（1976—），男，博士，教授，碩士研究生導師，主要從事分子免疫學研究，Email：shaohw2000@163.com。

Study on the expression and pairing efficiency of recombinant TCR

SU Chang，LIU Ting，HUANG Guorong，CHEN Churu，XIANG Jing，XU Chang，ZHANG Wenfeng，SHEN Han，SHAO Hongwei
（Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates，School of Life Science& Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Abstract：Objective To investigate the expression and assembly of chimeric TCR chains based on modification of the constant domain of exogenous TCRs，and its contribution on mismatch between exogenous and endogenous TCRs in TCR genetically modified T cells（TCR-T），which may provide a foundation for T cell adoptive immunotherapy.Methods Three kinds of TCRs，including wild type TCR，chimeric TCR（chim-TCR）and hybrid TCR，were transferred into BEL-7402 cells，respectively.The expression of TCR molecules was determined by analysis of the reporter gene expression.The assemble efficiency of those different TCRs was calculated by fluorescence resonance energy transfer（FRET）.

Results Chim-TCR molecules were effectively expressed and assembled in host cells.The FRET efficiency between chimeric TCR and wild-type TCR（chim-wild TCR）was significantly less than that of chim-chim or wild-wild type TCRs.Conclusion The chim-TCR can be effectively expressed and assembled in BEL-7402 cells.The targeted modification of TCR domain can significantly reduce the mismatch between chimeric TCR and wild-type TCR chains，which provide an evidence for adoptive TCR-T immunotherapy.

Key words：chimeric TCR；expression；assembly；FRET