急性胰腺炎相關性肺損傷小鼠肺組織蛋白組學初步研究

冼慧儀，盧心鵬2，曹志3，陳鴻生2，李風雷，廖東江2

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急性胰腺炎相關性肺損傷小鼠肺組織蛋白組學初步研究

冼慧儀1，盧心鵬2，曹志3，陳鴻生2，李風雷1，廖東江2

（1.廣州醫學院荔灣醫院，廣東廣州510120；2.呼吸疾病國家重點實驗室，廣東廣州510230；3.華南師范大學藥物研究院，廣東廣州510631）

摘要：目的應用蛋白質組學方法篩選急性胰腺炎相關性肺損傷（APALI）小鼠模型與正常小鼠肺組織蛋白質表達差異，為闡明APALI的發病機制和預后提供理論依據。方法20只BALB/c小鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組通過腹腔注射雨蛙肽的方法造模，造模后處死小鼠取左肺組織進行病理學分析，右肺組織提取肺組織總蛋白，用雙向電泳加質譜的技術路線進行蛋白質組學分析。結果分析差異蛋白質功能，發現差異蛋白質主要與炎癥反應及氧化還原相關。結論炎癥浸潤、組織細胞損傷引起的氧化應激損傷可能在APALI發病早期扮演重要角色，在APALI早期重視抗氧化治療可有助于改善預后。

關鍵詞：急性胰腺炎相關性肺損傷；動物模型；蛋白質組學

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是以自體胰腺消化和胰腺壞死為主要特征的一種全身性疾病，該病具有病程進展極快、并發癥多和病死率高等特點。APALI是AP最常見的并發癥，其發生率可高達65%左右，繼發急性呼吸窘迫綜合征達20%左右，是急性胰腺炎患者早期死亡的重要原因［1］。有

網絡出版時間：2016-05-30 11：07 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1107.007.html研究認為中性粒細胞激活、胰酶、氧化損傷、細胞因子、補體系統、激肽、一氧化氮、內皮素及炎癥介質等因素的相互作用與影響在急性胰腺炎相關性肺損傷（acute pancreatitis-associated 1ung injury，APALI）發病中起著重要的作用［2］。目前由于APALI的相關發生機制尚不明確，導致臨床治療也缺少有效的治療方案，因此迫切需要明確其損傷機制。本研究應用蛋白質組學的相關技術，分析APALI小鼠模型肺組織與正常小鼠肺組織差異表達蛋白質與APALI發病的關系，從蛋白質表達水平初步闡明APALI的發生機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性BALB/c小鼠20只，體質量16～18 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號SCXK（湘）2011-0003。小鼠隨機分配為實驗組和對照組，每組10只。

1.2 主要試劑

Bradford蛋白定量試劑盒、pH固相梯度干膠條（IPG strip pH3-10NL，17 cm）、1.5 mol/L Tris-HCl （pH 8.8）、載體兩性電解質（pharmalyte，pH3～10）、碘乙酰胺、過硫酸銨（APS）均為Bio-Rad公司產品；尿素（Urea）、二硫蘇糖醇（DTT）、CHAPS、SDS、TEMED、Tris堿（Tris-base）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、硫脲（Thiourea）、三氟乙酸（TFA）、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CCA）、戊巴比妥鈉、雨蛙肽（Caerulein）均為Sigma公司產品；無水乙醇、95%（φ）乙醇、蘇木素染液、伊紅染液、鹽酸、TO、中性樹膠、考馬斯亮藍R-250等購自廣州化學試劑廠。

1.3 主要儀器

RM2245切片機、DM4000B熒光顯微鏡（Leica公司）；IPGphor等電聚焦儀、proteanⅡxi cell垂直電泳槽、Image ScannerⅡ透射掃描儀（Bio-Rad公司）；Imagemaster 2D 5.0圖像分析軟件（GE公司）；4800 PLUS MALDI-TOF-TOF質譜儀（AB SCIEX公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 APALI小鼠模型造模及肺組織標本采集

APALI小鼠模型造模采用Craig等［3］的方法，禁食過夜后分別用10 mg/kg劑量的雨蛙肽和生理鹽水腹腔注射小鼠，每小時注射1次，共8次，首次注射24 h后結束動物實驗。動物實驗結束后用致死劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射處死小鼠，快速采集小鼠的肺組織備用。

1.4.2 小鼠肺組織病理標本的處理及HE染色 將新鮮的小鼠左肺組織用生理鹽水沖洗后，于4%（φ）多聚甲醛固定液中固定48 h，然后用0.01 mol/L PBS液洗滌3次；梯度酒精（70%～100%）進行脫水，共20～30 h；二甲苯透明20～40 min，60℃石蠟浸潤4～4.5 h，最后用石蠟包埋。將包埋好的組織石蠟塊進行常規肺組織切片（5 μm厚），撈于玻片上，60℃干燥箱干燥24 h。TO 10 min，2次，蘇木素染色1 min，1%（φ）鹽酸酒精脫色10 s，流水沖洗10 min，伊紅染色10 s，流水沖洗10 min，55℃烘20 min后用中性樹膠封片。

1.4.3 肺組織總蛋白的制備 將小鼠右肺組織用預冷PBS反復沖洗，去除血液并剪去多余結締組織及脂肪組織，吸干組織表面水分。每組10只小鼠肺組織各取0.5 g混合在一起后剪碎，移入預冷的玻璃勻漿器中加入裂解緩沖液（7 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，4%CHAPS，65 mmol/L DTT，0.5 mmol/L EDTA，2 mmol/L PMSF）勻漿；冰上靜置30 min，4℃17 000 g/min離心60 min，取上清即為總蛋白質。用Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白質的濃度。

1.4.4 雙向凝膠電泳 雙向電泳參照G?rg等［4］的方法進行。第一相等電聚焦（IEF），取850 mg小鼠肺組織蛋白，上樣量總體積為0.35 mL。30 V主動水化12 h后進行等電聚焦，等電聚焦的總伏小時數為80 000 Vh。等電聚焦結束后，迅速取出IPG膠條，分別進行2次平衡，各15 min。將平衡好的膠條轉入垂直電泳槽中進行第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠濃度為12%，電泳條件：10 mA電流恒流每塊膠電泳30 min，然后每膠25 mA，直至溴酚藍指示線到達凝膠底部停止電泳。凝膠用考馬斯亮藍R-250染液染色后掃描，得到的雙向電泳圖譜通過ImageMaster 2D Elite 5.0圖像分析軟件進行分析。

1.4.5 質譜分析 沿邊緣切取凝膠上的差異蛋白質點（表達量差異在2倍以上），置于EP管內。用含50 mmol/L碳酸氫銨的 50%（φ）乙腈脫色20 min，乙腈脫水，加入5 μL的胰蛋白酶（12.5 ng/μL）于冰上吸漲后，加入20 μL的覆蓋液（含50 mmol/L碳酸氫銨的10%乙腈）于37℃過夜。吸出上清轉移到新EP管，真空凍干。然后將干燥的肽段重新溶解于CHCA溶液（0.5 g/L，由0.1%TFA和50% CAN配制）中，與基質混合點到不銹鋼MALDI靶板上作質譜分析。MALDI-TOF-MS質譜分析采用正離子反射模式，用ABI 4700 Calibration Mixture作為外標校正，掃描范圍為800～4 000。從一級質譜的肽質量指紋圖譜中選擇信噪比（signal-to-noise ratio，S/ N）大于50的5個得分最高的8個前體離子作MS/ MS分析，質譜信號累計掃描1 500次。

1.5 數據庫檢索

數據用 GPS Explorer軟件（V3.6，Applied Biosystems）在NCBI數據庫搜庫。檢索條件：物種來源為小鼠，肽片段分子量最大容許誤差控制±0.3 u，酶解片段不完全選擇為1個，離子選擇［M+H］和monoisotopic，固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為蛋氨酸氧化。

2 結果

2.1 兩組小鼠肺組織HE病理片結果

見圖1。對照組小鼠肺組織鏡下結構清晰，上皮、內皮細胞結構正常，血管無充血，間質無滲出、增厚，無明顯炎性細胞浸潤。模型組小鼠肺組織鏡下可見大片肺組織間質水腫，血管充血，肺泡腔內大量滲出，肺泡間隔增厚，伴大量中性粒細胞浸潤。提示動物APALI模型成功建立。

A.對照組；B.APALI模型組。圖1 肺組織HE病理切片（20×）Figure 1 Pathological examination of mouse lung tissue by H-E staining（20×）

2.2 小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜分析

通過雙向電泳技術獲得了分辨率高、重復性好的對照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜（圖2）。分析同一樣本的3塊膠，相同蛋白質點在不同膠的位置上有較好的重復性，從而建立了重復性較好的對照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織雙向凝膠電泳圖譜。對照組小鼠與APALI模型小鼠肺組織分別有（1 135±50）個點和（1 027±50）個點得到分離，對照組匹配點數為（985±20）個，APALI模型組匹配點數為（918±15）個，其平均匹配率分別為86.7%和89.3%。對斑點位置進行重復性檢測，在IEF方向的平均偏差為（1.05±0.17），SDSPAGE方向的平均偏差為（1.15±0.23），選取各組重復膠中均有相同變化且表達量相差2倍以上的蛋白質點為差異表達蛋白質，結果共有32個差異表達的蛋白點，其中30個蛋白點在實驗組中表達上調，2個蛋白點在實驗組中表達下調（6號和22號點）。

A.對照組；B.APALI模型組（圖中標記1-32點為在兩組中高表達的蛋白質點，與表1中鑒定的蛋白質點編號相對應）。圖2 小鼠肺組織雙向凝膠圖譜Figure 2 2-DE of mouse lung tissue

2.3 差異蛋白質點MALDI-TOF-MS的鑒定

對差異表達蛋白質進行質譜分析及數據庫檢索，共獲得了28個蛋白質信息，9號、13號及30號蛋白質點未鑒定出（見表1、圖2）。

2.4 差異蛋白質功能分析

經檢索，差異表達蛋白功能涉及氧化還原、細胞骨架變化、胞內異常蛋白降解及能量代謝等過程，提示APALI發病過程中肺組織可能存在氧化應激加重、組織細胞異常蛋白合成增加及能量代謝異常等改變。

3 討論

蛋白質組學概念的提出及其研究技術的迅速發展，為人們從蛋白質整體水平上尋找疾病相關分子標志物和治療靶點成為現實。蛋白質組學在免疫、腫瘤形成等方面已經取得了重大進展，在APALI研究尚處于初期階段。目前APALI發病機制的研究還主要集中于細胞因子和趨化因子，例如TNF-α、IL-1β、CINC/IL-8、CCR1、MIF（IL-18、IL-10）等在APALI病理過程中募集炎癥細胞介導炎癥反應的研究［5-7］。而在蛋白質表達水平上系統地對APALI進行蛋白質組學研究未見報道。

本研究以APALI小鼠模型肺組織為研究對象進行蛋白質組學的研究。成功構建了APALI與正常肺組織的2-DE圖譜，通過質譜分析和數據庫檢索，初步篩選出28種可能與APALI發病機制密切相關的蛋白質。其中熱休克蛋白27（heat shock protein，HSP）、TCP1伴侶蛋白、蛋白酶體活化復合體、蛋白酶體α4亞單位、泛素結合酶等主要參與細胞內保護穩定正常蛋白、修復或降解異常蛋白等生化過程，在細胞受到有害刺激時可幫助維持細胞穩態，并參與細胞周期調控［8-9］。APALI發生時，肺組織存在廣泛炎癥浸潤尤其是中性粒細胞浸潤?；罨难仔约毎置诖罅康鞍酌浮⒀装Y因子等，可導致肺組織細胞（內皮細胞、肺泡上皮細胞等）發生損傷，這些刺激因素可能導致細胞產生大量異常蛋白，誘導了分子伴侶蛋白和蛋白酶體相關蛋白、泛素結合酶等的應激性表達上升［8］。凝溶膠蛋白和膠轉蛋白參與細胞骨架的調節，也可調控細胞運動和凋亡，同時對T細胞免疫活力的維持也有重要作用［10-11］。APALI發病過程中，大量炎癥細胞被募集移行到肺組織，局部肺組織細胞大量凋亡，這些過程均涉及細胞骨架的劇烈變化［10-11］，可能引起凝溶膠蛋白和膠轉蛋白表達顯著上升。NADH-泛醌還原酶、UMP-CMP蛋白激酶、a-異檸檬酸脫氫酶、左旋乳酸脫氫酶、SEC14L3等則主要參與生物氧化、三羧酸循環、氧化磷酸化反應、氧化呼吸鏈、糖酵解和糖異生，可能反映了肺損傷狀態下肺組織細胞存在能量代謝異常［13］，并導致能量代謝相關酶的代償性表達上升［14］。Prx6（過氧化物酶6）有抗氧化和清除自由基的作用，在抗氧化應激中有重要作用，同時還有PLA2活性，參與肺表面活性物質的代謝［7］。其表達的增加也提示APALI發病后肺組織氧化應激加重，導致相關抗氧化酶代償性增強。

表1 差異表達蛋白質點檢索結果Table 1 Identification and characterization of proteins by MS

從本研究發現的差異蛋白功能類型來看，肺組織炎癥浸潤、組織細胞損傷是APALI重要病理過程，使肺組織處于高耗能、高代謝狀態。浸潤炎性細胞的各種活性分泌物及損傷細胞的死亡解體，會顯著加重肺組織的氧化應激負荷，在急性期誘導相關抗氧化酶的代償性表達。大量研究表明，氧化損傷在急性肺損傷中扮演重要角色，本研究結果表明氧化損傷在APALI發病早期也扮演重要角色，在APALI早期重視抗氧化治療或有助改善預后。

通過對APALI小鼠模型肺組織的蛋白質組研究發現，在APALI造模過程中許多蛋白參與病理生理變化，大范圍的炎癥浸潤可能導致了廣泛的肺組織細胞損傷，同時引起局部氧化應激加重，影響機體的預后。因此，全面了解APALI蛋白質表達變化的情況及生理功能作用機制，為APALI患者臨床治療、預后提供理論依據和實踐基礎。

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（責任編輯：幸建華）

中圖分類號：R657.5+1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0374-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041402

收稿日期：2016-04-14

作者簡介：冼慧儀（1981—），女，碩士，主要從事呼吸內科學臨床及基礎研究，Email：xianhuiyi1111@163.com；通信作者：廖東江（1979—），男，助理研究員，主要從事蛋白質組學研究，Email：liaodongjiang79@163.com。

Proteomics analysis of acute pancreatitis-associated lung injury in mice

XIAN Huiyi1，LU Xinpeng2，CAO Zhi3，CHEN Hongsheng2，LI Fenglei1，LIAO Dongjiang2
（1.Liwan Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou 510120，China；2.State Key Laboratory of Respiratory Disease，Guangzhou 510230，China；3.Institute of Pharmaceutical Research，South China Normal University ，Guangzhou 510631，China）

AbstractObjective To screen the differentially expressed proteins of lung tissue between acute pancreatitis-associated lung injury APALI mice and wild type wt mice by using proteomics methods which may provide an evidence for study of the pathogenesis and prognosis of APALI.Methods 20 BALB/ c mice were randomly divided into the experimental and control groups.Caerulein was injected intraperitonealy to establish the APALI model.Mice were sacrificed after one day of caerulein injection and left lung was collected for pathology examination.Total proteins from right lung were extracted for 2-DE and proteomics research.The differentially expressed protein spots were identified to explicit the biological functions.Results The lung-injury symptoms were observed in experimental mice.The differentially expressed proteins were closely related to inflammatory and redox reactions.Conclusion Oxydative stress induced by inflammatory infiltration and tissue injury is crucial in the early development of APALI. Antioxydant treatment in the early stage may be helpful for prognosis of APALI.

Key wordsAPALI；animal model；proteomics