中藥黃芩對多重耐藥哈維弧菌耐藥性的逆轉作用

王雅茹，葉清清，方偉彬，劉廣鋒，馮娟，管淑玉

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中藥黃芩對多重耐藥哈維弧菌耐藥性的逆轉作用

王雅茹1，葉清清1，方偉彬1，劉廣鋒2，馮娟2，管淑玉1

（1.廣東藥科大學中藥學院/國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室/廣東高校中藥質量工程技術研究中心，廣東廣州510006；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，廣東廣州510300）

摘要：目的研究中藥黃芩對多重耐藥哈維弧菌的耐藥逆轉作用并初步探討其作用機理。方法 以耐阿莫西林、呋喃唑酮和紅霉素的哈維弧菌X12XC30為實驗對象，用倍比稀釋法測定黃芩對菌株X12XC30的亞抑菌濃度；以SDS為對照，采用影印培養法測定黃芩作用24 h和48 h的耐藥逆轉率；通過質粒凝膠電泳觀察黃芩對該菌株質粒的消除情況。結果 黃芩對阿莫西林和呋喃唑酮的總逆轉率為3.00%（24 h）和4.33%（48 h）；SDS對阿莫西林和呋喃唑酮的總逆轉率為0.33%（24 h）和1.33%（48 h）。結論 黃芩對多重耐藥哈維弧菌有耐藥逆轉作用。

關鍵詞：黃芩；哈維弧菌；多重耐藥；耐藥性逆轉

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隨著抗生素的廣泛應用，細菌耐藥問題日益突出，多重耐藥菌株的出現，嚴重影響了人類的公共安全。新型抗生素投入使用不久即迅速產生耐藥細菌，因此，細菌耐藥性的逆轉成為國內外研究人員研究的熱點［1］。我國有豐富的中藥資源，很多中藥有廣泛的抗炎抑菌等作用，已有研究報道蛇莓［2］、千里光［3］等中藥對多重耐藥菌有耐藥逆轉的作用。

哈維弧菌是一種常見的海洋致病菌，在海水魚蝦的養殖中廣泛存在，其引發的感染流行廣，死亡率高，給海水養殖和公共安全造成巨大隱患。本實驗選用分離自海水養殖魚類的耐阿莫西林、呋喃唑酮和紅霉素的哈維弧菌X12XC30為實驗對象，研究中藥黃芩對該菌株的耐藥逆轉效果。

1 儀器與材料

1.1 藥材與試劑

黃芩（批號140401，廣州致信藥業有限公司），水煎煮制備成質量濃度為1.0 g/mL的藥液備用；阿莫西林膠囊（批號41500954，廣州白云山制藥股份有限公司，配制成質量濃度為10 mg/mL的藥液備用）；呋喃唑酮片（批號C140603，山西云鵬制藥有限公司，配制成質量濃度為10 mg/mL的藥液備用）；SDS（批號2015032042，天津市致遠化學試劑有限公司）；質粒小提試劑盒、DNA Maker 15000［天根（北京）生化科技有限公司］；酵母提取粉（批號3202068，廣東環凱微生物科技有限公司）；細菌學蛋白胨（批號3204084，廣東環凱微生物科技有限公

司）；瓊脂粉（批號9002-18-0，廣州菲博生物科技有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

RE-52CS旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限公司）；FA2004B電子天平（上海一恒科學儀器有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；MJ-78A高壓滅菌鍋（美國STIR）；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；SPX-150B-Z生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）；Tocan凝膠成像儀（上海領成生物科技有限公司）；BG-Power 300電泳儀（北京百晶生物科技有限公司）；臺式高速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）。

1.3 菌株

哈維弧菌（Vibrio Harveyi）X12XC30由中國水產科學研究院南海水產研究所分離鑒定、命名并保藏。培養基為2216E培養基，配制方法參照文獻［4］。

2 方法與結果

2.1 多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥性的檢測

采用紙片擴散法（K-B法）對多重耐藥哈維弧菌X12XC30進行藥敏實驗，參照《抗菌藥物藥敏紙片判斷標準》［5］判定耐藥性結果，如表1，得知菌株X12XC30耐阿莫西林、紅霉素和呋喃唑酮抗生素。

表1 多重耐藥哈維弧菌X12XC30的耐藥性結果Table 1 Results of drug-resistance of Vibrio Harvey X12XC30

2.2 耐藥性逆轉實驗

2.2.1 藥物亞抑菌濃度的測定 通過倍比稀釋法進行確定［6］，方法如下：制備濃度為1×106CFU/mL的菌懸液，取菌懸液100 μL分別加入含100 μL不同濃度黃芩（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.90 mg/mL）的2216E液體培養基中。對照組不加藥只加細菌。28℃恒溫培養24 h，以肉眼觀察有細菌生長的最大濃度為黃芩的亞抑菌濃度。SDS、阿莫西林和呋喃唑酮的亞抑菌濃度測定方法同上。得知黃芩、SDS、阿莫西林、呋喃唑酮的亞抑菌濃度分別為31.25、12.5、1.25、0.31 mg/mL。

2.2.2 黃芩對多重耐藥哈維弧菌耐藥逆轉實驗的研究 參照質粒消除試驗［6］，并與耐藥逆轉的定義相結合，研究藥物對多重耐藥哈維弧菌的耐藥逆轉實驗。具體方法如下：

亞抑菌濃度的黃芩培養菌株X12XC30，分別于24 h和48 h后取100 μL菌液涂布于2216E平板培養。24 h后挑選300個單菌落（檢測菌落總數），分別影印于含阿莫西林（1.25 mg/mL）和呋喃唑酮（0.31 mg/mL）的 2216E平板上以及不含藥物的2216E平板上，28℃恒溫培養24 h，觀察并記錄結果。陰性對照組中，細菌未經藥物作用，其他同上；陽性對照組中，藥物用亞抑菌濃度的SDS替代，其他同上。

選擇在含藥平板上不生長、而在不含藥的普通平板上生長的菌落，采用倍比稀釋法測定抗生素對此菌的MIC，以原哈維弧菌X12XC30的MIC作對照，若MIC值由耐藥濃度變成敏感濃度，則此菌即為耐藥逆轉菌。根據耐藥逆轉菌落數與檢測菌落總數之比，計算測試菌的耐藥逆轉率。見表2～3。

耐藥逆轉率=B（耐藥逆轉菌落數）/A（檢測菌落總數）×100%

表2 藥物作用24 h后多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥逆轉實驗結果Table 2 Results of drug-resistance reversion of Vibrio Harvey X12XC30 after treated by medicine at 24 h

表3 藥物作用48 h后多重耐藥哈維弧菌X12XC30耐藥逆轉實驗結果Table 3 Results of drug-resistance reversion of Vibrio Harvey X12XC30 after treated by medicine at 48 h

由實驗數據可知，多重耐藥哈維弧菌X12XC30 在24 h和 48 h均沒有自發耐藥逆轉；以菌株X12XC30為實驗對象，黃芩作用24 h的耐阿莫西林逆轉率為2.00%，耐呋喃唑酮逆轉率為1.00%，總耐藥逆轉率為3.00%；SDS作用24 h的耐阿莫西林逆轉率為0，耐呋喃唑酮逆轉率為0.33%，總耐藥逆轉率為0.33%。由此可知，黃芩對菌株X12XC30耐阿莫西林的逆轉作用好于耐呋喃唑酮的逆轉作用，黃芩對菌株X12XC30的耐藥逆轉作用好于SDS，經卡方檢驗可知，黃芩組和SDS組差異有統計學意義（P＜0.05）。黃芩作用 48 h耐阿莫西林逆轉率為2.67%，耐呋喃唑酮逆轉率為1.67%，總耐藥逆轉率為4.33%；SDS作用48 h耐阿莫西林逆轉率為0.33%，耐呋喃唑酮逆轉率為1.00%，總耐藥逆轉率為1.33%，由此可知，黃芩對菌株X12XC30耐阿莫西林的逆轉作用好于耐呋喃唑酮的逆轉作用，黃芩對菌株X12XC30的耐藥逆轉作用好于SDS。經卡方檢驗可知，黃芩組和SDS組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 耐藥逆轉菌的質粒分析

挑取耐藥逆轉菌落，于2216E液體培養基培養過夜，用DNA小提試劑盒抽提質粒，0.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統觀察，以未經藥物作用的哈維弧菌X12XC30的質粒圖譜為對照，對比耐藥逆轉菌株的質粒是否消失。由圖1可知，經31.25 mg/mL的黃芩作用后得到的耐阿莫西林逆轉菌株和耐呋喃唑酮逆轉菌株的質粒均未被消除。

1.耐阿莫西林逆轉菌株；2.耐呋喃唑酮逆轉菌株；3.菌株X12XC30；4.DNA Maker 15 000。圖1 黃芩作用前后菌株質粒圖譜Figure 1 Plasmid profile analysis of Vibrio Harvey before and after treated by scutellaria baicalensis

3 討論

細菌耐藥性的產生和傳播使新型抗生素的使用周期大大縮短，多重耐藥菌的日益嚴重已成為全球關注的公共安全問題。開發新型的細菌耐藥性逆轉劑已成為抗菌研究的新策略。與EB、SDS等化學耐藥逆轉劑相比，中藥耐藥逆轉劑的作用毒性較小，有良好的應用前景。翟如波等［7］報道五倍子、防風等中藥對金黃色葡萄球菌均有一定的耐藥逆轉作用；高迎春［8］等研究發現地錦草提取物可以使部分耐藥大腸桿菌變為敏感菌。

本研究選用多重耐藥哈維弧菌X12XC30為實驗對象，研究其經亞抑菌濃度的黃芩提取液作用后菌株的耐藥逆轉情況，結果表明中藥黃芩對多重耐藥哈維弧菌有較強的耐藥逆轉作用，其作用好于傳統消除劑SDS，差異有統計學意義；對比黃芩提取液對菌株耐阿莫西林的逆轉率和耐呋喃唑酮的逆轉率可知，黃芩提取液對菌株耐阿莫西林的逆轉作用好于耐呋喃唑酮的逆轉作用，為中藥黃芩作為耐藥逆轉劑提供了實驗依據。

藥物耐藥逆轉的機制有消除耐藥質粒、促進藥物進入、減少藥物泵出、抑制滅活酶、抑制酶的活性等［9-10］。本實驗通過研究藥物作用前后質粒的消除情況初步探討了中藥黃芩逆轉菌株耐藥作用的機制。實驗結果表明，黃芩作用后的耐阿莫西林逆轉菌株和耐呋喃唑酮逆轉菌株的質粒均未被消除。質粒圖譜出現3個條帶與2個條帶的差異可能與質粒DNA的構型有關。黃芩逆轉哈維弧菌的耐藥性是否與其他作用機制相關有待于進一步研究。

參考文獻：

［1］李俊超.中藥耐藥抑制劑篩選及耐藥抑制機理研究［D］.湖南：湖南農業大學，2010.

［2］林居純，舒剛，馬馳，等.蛇莓水提物對臨床菌株質粒消除作用及生物膜形成的影響［J］.中國獸醫學報，2014， 34（2）：264-268.

［3］沈紅仙.千里光消除大腸埃希菌R質粒的實驗研究［J］.新中醫，2015，47（5）：276-277.

［4］管淑玉，林家勤，曾宇，等.5種中草藥提取物對致病性弧菌的抑菌作用研究［J］.廣東藥學院學報，2008，24（3）：269-271.

［5］國家抗菌藥物細菌耐藥性監測中心.藥物藥敏紙片判斷標準［M］.北京：中國藥品生物制品檢定所，2000：13-14.

［6］王小平，劉海江，甄蕾，等.松蘿酸對金黃色葡萄球菌耐藥質粒的消除作用［J］.中藥材，2006，29（1）：36-39.

［7］翟如波，王禹，朱荔清.逆轉耐甲氧西林金黃色葡萄球菌多耐藥性作用的中藥篩選初探［J］.沈陽部隊醫藥，2007，20（1）：23-24.

［8］高迎春，魏秀麗，張傳津，等.地錦草等中藥提取物對大腸桿菌耐藥消除作用的初步研究［J］.中國獸藥雜志，2010，44（11）：12-16.

［9］李科，張德純.細菌耐藥機制及耐藥性消除的研究進展［J］.中國微生態學雜志，2014，26（8）：984-990.

［10］ETIENNE J，GERBAUD G，COURVALIN P.PlasmidmediatedresistancetofosfomycininStaphylococcus epidermidis［J］.FEMS Microbiol Letters，2006，61（2）：133-138.

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0366-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016012204

收稿日期：2016-01-22

基金項目：國家自然科學基金項目（81001702）；廣州市科技計劃產學研協同創新重大專項（201508020016）；海南省科技興海專項（2015XH03）

作者簡介：王雅茹（1990—），女，2013級碩士研究生，Email：18814099564@163.com；通信作者：管淑玉（1976—），女，博士，副教授，主要從事中藥質量控制與生物活性研究，Email：guanshy3@163.com；馮娟（1973—），女，研究員，主要從事細菌性疾病及免疫防治研究，Email：juanf@21cn.com。

Reverse effect of scutellaria baicalensis on multi-drug resistant Vibrio Harveyi

WANG Yaru1YE Qingqing1FANG Weibin1LIU Guangfeng2Feng Juan2GUAN Shuyu1
1.School of Traditional Chinese Medicine Guangdong Pharmaceutical University National Key Laboratory of Digital Quality Evaluation Technology of Chinese Traditional Medicine and Guangdong University of Traditional Chinese Medicine Quality Engineering Technology Research Center Guangzhou 510006 China 2.South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences Guangzhou 510300 China

AbstractObjective To study the reverse effect of scutellaria baicalensis on multi-drug resistant Vibrio Harveyi and its potential mechanism.Methods Vibrio Harvey X12XC30 was selected owing to its resistant to amoxicillin furazolidone and erythromycin.The sub-MIC concentration of scutellaria baicalensis was determined by the double dilution method.With SDS as a positive elimination agent the reversal rate of amoxicillin and furazolidone was analyzed by using photolithography.Agarose gel electrophoresis was used to observe the plasmid-eliminated situation.Results After treatment with scutellaria baicalensis the total reversal rate of Vibrio Harveyi to amoxicillin and furazolidone was 3.00% 24 h and 4.33% 48 h while the reversal rate of SDS was 0.33% 24 h and 1.33% 48 h .Conclusion Scutellaria baicalensis has the reverse effect on multi-drug resistant Vibrio Harveyi.

Key wordsscutellaria baicalensis Vibrio Harveyi multi-drug resistant reversal of resistance