產后甲狀腺炎患者樹突狀細胞免疫功能的研究

羅毅平，張艷，張溫麑，黃珊，甘艷微，余丹峰（廣東省婦幼保健院，廣東廣州511400）

?

產后甲狀腺炎患者樹突狀細胞免疫功能的研究

羅毅平，張艷，張溫麑，黃珊，甘艷微，余丹峰
（廣東省婦幼保健院，廣東廣州511400）

摘要：目的通過對產后甲狀腺炎（PPT）患者外周血樹突狀細胞（DCs）免疫功能及狀態的觀察，探討DCs與PPT發生發展的關系。方法用流式細胞術（FACS）分別檢測經培養后來源于PPT患者及正常健康人外周血DCs上CD83、CD80、CD86的表達水平。結果來源于PPT患者外周血DCs上CD83、CD80、CD86分子的表達水平顯著高于正常組（P＜0.05），同種混合淋巴細胞反應顯示PPT患者組DCs免疫刺激能力顯著高于正常組（P＜0.01）。結論DCs免疫功能及成熟分化的增加與PPT的發生密切相關。 關鍵詞：產后甲狀腺炎；樹突狀細胞；免疫功能 中圖分類號：R714.14+7

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0379-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041701

產后甲狀腺炎（PPT）是發生在產后的一種自身免疫性甲狀腺疾病，可見于正常分娩或流產婦女。研究提示PPT的發生與宿主的免疫功能變化尤其是T淋巴細胞的分化密切相關［1］。樹突狀細胞（DCs）是目前發現的功能最強，也是唯一能激活初始型T細胞的抗原提呈細胞，在T細胞的分化過程中具有重要作用。已有研究表明DCs是啟動自身免疫性疾病如系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥、自身免疫性腦脊髓炎等疾病參與發病的主要細胞，其通過捕獲并提呈抗原，轉移至淋巴結，表達共刺激分子、激活T細胞及分泌細胞因子等作用啟動免疫應答，參與免疫病態反應［2］。然而目前國內外未見有關于PPT發病中DCs的免疫調節功能的研究。本實驗通過觀察PPT患者與健康人外周血單核細胞源性DCs的成熟狀態及免疫功能的差異，探討DCs 與PPT發病的相關性。

網絡出版時間：2016-05-20 9：51 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160520.0951.001.html

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Calibur型流式細胞儀（美國BD Bioscience公司）；液閃計數儀（美國PerkinElmer公司）；Ficoll人淋巴細胞分離液（美國 GE Healthcare公司）；RPMI1640培養液（美國Hyclone公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；重組人白細胞介素4（rhIL-4）、重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（rhGMCSF）及鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG單克隆抗體均購自美國BD pharmingen公司。

1.2 研究對象及標本的選取

采集2012年10月—2015年12月在廣東省婦幼保健院內科就診的50例PPT患者（其中30例甲亢單相型，17例甲減單相型，3例甲亢甲減雙相型）外周靜脈血作為PPT組，以年齡、孕產次匹配50例健康產后婦女外周靜脈血作為正常對照組。兩組患者的年齡、孕產次比較，差異無統計學意義，具可比性（見表1）。PPT的診斷標準［3］：①妊娠前無甲狀腺疾病病史；②產后6個月內出現TSH異常并FT3、FT4水平異常；③甲狀腺TSH受體抗體陰性。排除標準［3］：①產后彌漫性甲狀腺腫伴甲狀腺功能亢進癥；②近期患有急性或慢性感染性疾病；③肝腎功能異常；④近期接受過激素或免疫抑制劑治療。實驗前所有研究對象均簽署知情同意書。入選的兩組患者分別于產后第90天取20 mL肝素抗凝外周血，以Ficoll淋巴細胞分離液梯度離心富集單個核細胞，RPMI1640液洗滌細胞3次，調整細胞數待用。

表1 正常人及PPT患者一般臨床資料情況Table 1 Clinical data of PPT patients and health donors

1.3 DCs的體外培養及富集

人外周血單個核細胞以合適的密度接種于培養瓶內，用含10%（φ）的胎牛血清的RPMI1640培養液，在恒溫箱中培養 2 h后遺棄未貼壁細胞，用RPMI1640液輕洗2遍貼壁細胞，再加入4 mL含rhIL-4 500 U/mL和rhGM-CSF 1 000 U/mL細胞因子的完全培養基中培養；每2天全量換液1次，共培養7 d。

1.4 透射電鏡觀察細胞超微結構

培養7 d后收集足量的DCs，經PBS液洗2次后離心獲細胞沉淀，以25%（φ）的戊二醛4℃固定48 h后，再用10 g/L OSO44℃固定1 h，梯度乙醇脫水、包埋，超薄切片經醋酸鈾-枸櫞酸鉛復染后，透射電鏡觀察并照相。

1.5 流式細胞儀（FACS）檢測

培養結束收集細胞，用PBA懸浮為5×106細胞/mL，加入離心管，再加入濃度為5 μg/mL的鼠抗人CD80、CD86、CD83抗原IgG單克隆抗體100 μL，4℃標記30 min，PBA洗細胞1次，沉淀細胞加入FITC-標記兔抗鼠熒光二抗，4℃標記45 min，1%多聚甲醛 500 μL固定細胞，用 FACS檢測 CD80、CD83、CD86的表達水平，以熒光吸收度A表示。

1.6 同種混合淋巴細胞反應（MLR）

取健康人外周血20 mL，淋巴細胞分離液密度梯度離心后獲取單個核細胞層，用 PBS洗去血小板，37℃貼壁培養1 h，收集懸浮的細胞為同種異體T細胞。調整細胞濃度為1×106細胞/mL。收集培養7 d后的DCs，加入絲裂霉素C 25 μg/mL，37℃，溫育45 min。在32孔平底培養板種加入不同人的DCs 200 μL（2×104/孔），再加入健康人T細胞200 μL（2×105/孔），各3孔，在37℃、5%（φ）CO2的環境下培養96 h。于培養結束前16 h加入［3H］標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）2 μCi/孔，多頭細胞樣品收集儀收集細胞，烘干（80℃，30 min），加入閃爍液5 mL，用液閃計數儀，檢測3H-TdR的摻入率（cpm），結果用3孔的均值來表示。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 DCs形態學觀察

從外周血中獲取單個核細胞，貼壁培養后經rhGM-CSF和rhIL-4聯合誘導，第7天時產生大量DCs，平均從20 mL外周血中可誘導出（1.5～2.0）× 106個DCs，與其他報道相近［4］。培養24 h后大部分細胞貼壁生長，成簇排列，形態未見異常。48 h后，細胞出現不規則形態，同時懸浮細胞增多，以后隨著時間的延長，懸浮細胞逐漸增多，異形突起明顯。第3～4天時倒置顯微鏡下可見大部分細胞呈梭形及不規則形狀，細胞表面呈毛刺狀，第7天細胞生長茂盛，大部分細胞呈不規則形，并且伸出不規則突起，為典型DCs形態，見圖1。臺盼藍染色顯示，細胞活力在95%以上。

透射電鏡下可見DCs成不規則形，細胞表面粗糙，突起明顯。細胞核呈腎形和馬蹄形，核內異染色質較多，呈團塊狀，集中分布于核膜處，核漿比增大，胞質中細胞器較少，可見少量線粒體，溶酶體偶見，見圖2。

圖1　倒置顯微鏡下培養第7天的DCs形態（400×）Figure 1 Morphology of DCs cultured at 7 days by inverted microscope（400×）

圖2　電鏡下培養第7天的DCs形態（8 000×）Figure 2 Morphology of DCs cultured at 7 days by electron microscope（8 000×）

2.2 DCs表面CD80、CD86及CD83的表達

FACS分析結果顯示，培養7 d后的PPT患者

DCs表面CD80、CD86及CD83表達均顯著高于正常組（P＜0.05）。見表2、圖3。

表2 正常組及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表達率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

表2 正常組及PPT患者DCs表面分子CD80、CD86及CD83的表達率（n=50，%，±s）Table 2 Expression of CD80，CD86 and CD83 in the surface of DCs from PPT patients and health donors

與正常組比較，*P＜0.05

組別　CD80　CD86　CD83 PPT組　61.41±7.47*　37.28±6.75*　7.18±1.59*正常組　41.76±7.35　29.68±7.32　5.44±1.17

圖3　FACS檢測培養第7天的DCs表面表型Figure 3 Phenotype characteristics of DCs cultured at 7 days detected by FACS

2.3 同種混合淋巴反應

正常組DCs作為刺激細胞的cpm值為10 000± 2 000，PPT患者組為30 000±3 000。PPT患者組DCs免疫刺激能力顯著高于正常組（P＜0.01）。單獨加入DCs和T細胞的本底摻入值（cpm）值均小于500。

3 討論

自日本學者于1977年首次提出產后甲狀腺炎的概念以來，許多學者相繼對本病進行了調查研究，歸納其臨床特征主要為產后1年內出現暫時性甲亢和/或甲低，131I攝取率降低，甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）升高，及甲狀腺病理呈淋巴細胞浸潤性甲狀腺炎改變。PPT是產后婦女的一種常見病。研究報道，PPT在產后婦女中的發病率是 1.1%～21.1%，碘充足地區患病率約7%，孕期及產后血清中TPOAb陽性者，發病率可高達33%～50%［5］。我國學者報告的PPT平均患病率是7.2%［6］。

T淋巴細胞介導的細胞免疫在PPT致病中起重要作用［7］。T細胞的活化需要協同刺激信號的參與，在參與T細胞激活的諸多協同刺激分子中，研究較多的是CD80、CD86共刺激分子，它們均為DCs相關分化抗原。DCs作為一種專職抗原遞呈細胞，通過其表面相應配體CD80和CD86與T細胞表面CD28分子相結合，從而啟動T細胞介導的免疫反應。在正常情況下，外周血中絕大多數DCs處于非成熟狀態，此時 DCs僅表達低水平的共刺激分子（CD80、CD86）和黏附分子，且較少表達CD83這一被認為是DCs充分成熟、有活性的標志物分子［8］。本研究發現，在GM-CSF和IL-4的聯合誘導下，PPT患者外周血DCs表面CD80、CD86分子的表達水平顯著高于正常人，其刺激T淋巴細胞增殖能力亦顯著高于來源于正常人外周血的DCs。另外，與健康人比較，PPT患者外周血經GM-CSF和IL-4聯合誘導后，更多地表達反映成熟、有活性DCs標記物CD83，表明獲得的是處于成熟狀態的DCs。推測原本未成熟的DCs逐漸分化為成熟的DCs，經過遷徙聚集在甲狀腺組織上介導免疫反應從而導致PPT的發生。PPT患者可表現為甲亢型、甲減型及甲亢甲減雙向型，因樣本量關系，本研究未將不同時期及不同甲狀腺功能表現PPT患者進行區分，這將是我們今后工作的方向。

綜上所述，DCs免疫功能的增強及成熟分化程度的提高與PPT的發生密切相關，這也為免疫抑制治療PPT提供了理論基礎及實驗依據。

參考文獻：

［1］MCLACHLAN S M，RAPOPORT B.Breaking tolerance to thyroidantigens：changingconceptsinthyroid autoimmunity［J］.Endocr Rev，2014，35（1）：59-105.

［2］GUERY L，HUGUES S.Tolerogenic and activatory plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity［J］.Front Immunol，2013（4）：59.

［3］謝紋，黎南中，程時武，等.產后甲狀腺炎婦女外周血調節性T細胞和輔助性T細胞表達水平分析［J］.臨床軍醫雜志，2015，43（3）：274-276.

［4］MORVA A，LEMOINE S，ACHOUR A，et al.Maruration and function of human dendritic cells are regulated by B lymphocyte［J］.Blood，2012，119（1）：106-114.

［5］BHATTACHARYYA R，MUKHERJEE K，DAS A，et al. Anti-thyroid peroxidase antibody positivity during early pregnancy is associated with pregnancy complications and maternal morbidity in later life［J］.J Nat Sci Biol Med，2015，6（2）：402-405

［6］樓寒鈺，吳藝捷.產后甲狀腺炎發病機制的研究進展［J］.醫學綜述，2010，16（9）：1382-1386.

［7］SWELAM E S，BAKR H G，MANSOUR M A.Postpartum thyroid dysfunction：a state of immunological dysregulation ［J］.Clinical Lab，2011，57（9/10）：731-739.

［8］PRYCZYNICZ A，CEPOWICZ D，ZAREBA K，et al. Dysfunctions in the mature dendritic cells are associated with the presence of metastases of colorectal cancer in the surrounding lymph nodes［J］.Gastroenterol Res Pract，2016：2405437.DOI：10.1155/2016/2405437.Epub 2015 Dec 29.

（責任編輯：王昌棟）

收稿日期：2016-04-17

基金項目：廣東省醫學科研基金立項課題（A2013077）

作者簡介：羅毅平（1976—），男，博士，主任醫師，主要從事妊娠合并內科疾病及危重癥的診治研究，Email：doctorluoyiping@ 126.com；通信作者：張艷（1979—），女，博士，主治醫師，主要從事妊娠合并內科疾病診治研究，Email：happydragon2012qq@126.com。

Study on the immune function of dendritic cells in postpartum thyroiditis patients

LUO Yiping，ZHANG Yan，ZHANG Wenlan，HUANG Shan，GAN Yanwei，YU Danfeng
（Guangdong Province Maternity and Child Care Hospital，Guangzhou 511400，China）

AbstractObjective To study the immune function of dendritic cells DCs from peripheral blood of postpartum thyroid PPT patients and explore the potential relationship between DCs and the pathogenesis of PPT.Methods Fluorescence activated cell sorter FACS was used to detect the expression of CD83 CD80 and CD86 in the surface of DCs cultured from the peripheral blood of PPT patients or healthy donors.

Results Compared with healthy donors DCs from the peripheral blood of PPT patients expressed higher levels of CD83 CD80 and CD86 P＜0.05 and the capability of T cell proliferation stimulated by DCs from PPT patients was higher either P＜0.01 .Conclusion The increased immune function of DCs may be a reason for the pathogenesis of PPT.

Key wordspostpartum thyroiditis dendritic cells immune function