參麥注射液關節腔注射對兔膝骨關節炎IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響

陳能，姚楠，許學猛，李鋼，曾得明，陳國材

?

參麥注射液關節腔注射對兔膝骨關節炎IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響

陳能1，2，姚楠3，許學猛1，李鋼4，曾得明1，2，陳國材1，2

（1.廣東省第二中醫院 骨科，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫藥大學 研究生院，廣東 廣州
510405；3.廣東省中醫藥工程技術研究院/廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州
510095；4.廣東食品藥品職業學院教務處，廣東廣州518172）

摘要：目的研究參麥注射液對兔膝骨關節炎模型的干預作用，并探討其作用機理。方法行前交叉韌帶切除法（ACLT）復制兔膝骨關節炎模型，予膝關節腔注射參麥注射液、透明質酸鈉4周后，取膝關節液及關節軟骨組織，用ELISA法檢測關節液白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平，RT-qPCR檢測關節軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達。結果與正常對照組比較，模型組關節液IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均明顯升高（P＜0.01），軟骨組織IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質酸鈉組關節液IL-1β、IL-6和TNF-α表達均顯著降低（P＜0.01），軟骨組織IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA均顯著降低（P＜0.05）。參麥注射液組與透明質酸鈉組各指標比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論參麥注射液對兔膝關節軟骨有一定的保護作用，其作用機制與下調關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平，降低軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達有關。

關鍵詞：兔膝骨關節炎；參麥注射液；白介素-1β；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種中老年人常見的慢性、進展性的關節退行性疾病，以滑膜增生、關節軟骨退變為主要病理改變。盡管目前對該病開展了多方面的研究，但其發病機制尚未十分清楚。關節腔注射透明質酸鈉是該病常用的治療手段，臨床與實驗研究均證實了其良好療效。近年來研究發現，人參皂苷能保護軟骨細胞，有效抑制軟骨退變［1-2］。參麥注射液由紅參、麥冬提取加工制成，含有多種人參皂苷［3］。研究表明［4］，人參皂苷能有效降低炎性細胞因子及基質金屬蛋白酶水平，保護關節軟骨細胞及細胞外基質，延緩KOA的惡化。本研究通過建立兔KOA模型，并用參麥注射、透明質酸鈉干預，觀察相關炎性細胞因子表達，探討藥物的作用機理。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雌性新西蘭兔32只，體質量2～2.5 kg，南方醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（粵）2011-0015。

1.2 實驗藥物與對照品

參麥注射液（規格：50 mL，雅安三九藥業有限公司）；透明質酸鈉注射液（規格：2.5 mL：25 mg，山東正大福瑞達制藥有限公司）。

1.3 主要試劑

兔白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；TRIzol（美國 Invitrogen公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Fermentas公司）；MaximaTMSYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix（2X）（美國Fermentas公司）；特異性引物（上海英濰捷基貿易有限公司）。

1.4 主要儀器及設備

IQTM5型熒光定量 PCR儀（美國 Bio-Rad公司）；Bio-RAD 680酶標儀（美國 Bio-Rad公司）；5424型小型高速離心機（德國Eppendorf公司）；-80 ℃ 超低溫冰箱（美國Thermo公司）；SmartSpec plus核酸蛋白測定儀（美國Bio-Rad公司）；Milli Q Plus超級純水儀（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 動物造模

取SPF級雌性新西蘭兔32只，按體質量大小隨機分成4組，取8只為正常對照組行假手術處理，其余均行前交叉韌帶切除法（ACLT）復制兔KOA模型［5］。造模手術后連續3 d按20萬U Bid青霉素肌注以預防感染。造模術后7 d，在明確無發生感染情況下，驅使動物每天進行30 min奔跑活動。

2.2 動物分組及給藥

成功復制KOA動物模型24只，模型動物按配伍組設計隨機分組方法分為：模型組8只，參麥注射液組8只，透明質酸鈉組8只，以上各組動物分別關節腔注射無菌生理鹽水、參麥注射液、透明質酸鈉，每周1次，每次0.3 mL，連續注射4周。

2.3 動物取材

末次給藥1周后，戊巴比妥鈉注射處死動物后，首先向膝關節腔內注入0.5 mL無菌生理鹽水，反復抽吸3次，然后抽取關節腔沖洗液0.5 mL，置于-20℃下冷凍保存。然后無菌操作下沿造模手術切口暴露膝關節腔，用手術刀取下股骨遠端與脛骨近端軟骨。

2.4 實驗觀察

2.4.1 膝關節形態觀察 處死動物后暴露膝關節腔，肉眼觀察滑膜及軟骨形態。

2.4.2 膝關節液IL-1β、IL-6、TNF-α的檢測 采用酶聯免疫吸附法（ELISA），按說明書操作步驟處理各組膝關節液，用酶標儀檢測關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2.4.2 膝關節軟骨IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達檢測 采用TRIzol、氯仿和異丙醇等試劑提取每個膝關節軟骨的總RNA，用核酸蛋白測定儀測定A260/ A280比值，算出RNA的濃度和純度。按照Fermentas公司RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit提供的實驗方法進行反轉錄操作，加入上述提取的總RNA，合成第一鏈cDNA。

根據GenBank提供的基因序列設計特異性引物，引物設計利用Beacon Designer 7.91生物軟件，用于擴增新西蘭兔內參18S（GenBank accession no. NR_033238）以及 IL-1β（GenBank accession no. M26295）、IL-6（GenBank accession no.DQ680161）、TNF-α（GenBank accession no.NM_001082263）基因的引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。設計的引物序列如表1所示。

表1 擴增基因的引物信息Table 1 Information of PCR primers

將cDNA 1 μL、dd H2O 9.5 μL、特異性引物F和R各1 μL、MaximaTMSYBR Green/Fluorescein 12.5 μL混合后共25 μL放入PCR儀進行擴增。步驟1：94℃×5 min；步驟2：94℃×30 s→55℃×30 s→72℃×50 s（45個循環）；步驟3：72℃×7 min。運用2-△△Ct法計算各組基因相對表達量。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 膝關節形態觀察

見圖1。正常對照組關節滑液透明質稍黏稠，軟骨表面光滑，色淡紅，關節囊無粘連。模型組關節滑液明顯增多，色淡黃，關節表面欠光滑，軟骨邊緣骨贅形成，滑膜明顯增生，關節囊粘連。參麥注射液組關節滑液稍增多，質稀，軟骨完整，色白，滑膜無明顯增生，關節囊無粘連。透明質酸組關節滑液稍增多，質稀，軟骨完整，色白，滑膜稍增生，關節囊部分粘連。

A.正常對照組；B.模型組；C.參麥注射液組；D.透明質酸鈉組。圖1 膝關節形態觀察Figure 1 Morphology of knee joint

3.2 ELISA法檢測膝關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平

結果見表2。與正常對照組比較，新西蘭兔關節液中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質酸鈉組新西蘭兔關節液中IL-1β、IL-6和TNF-α表達均顯著降低（P＜0.01）。

表2 各組關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平Table 2 Levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in synovial fluid in different groups（±s，n=8）　　ρ/（pg·mL-1）

表2 各組關節液IL-1β、IL-6、TNF-α水平Table 2 Levels of IL-1β，IL-6 and TNF-α in synovial fluid in different groups（±s，n=8）　　ρ/（pg·mL-1）

與正常對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01。

組別　IL-1β　IL-6　TNF-α正常對照組　16.42±0.73　17.24±0.73　18.83±0.90模型組　23.48±1.47##　24.08±1.26##　25.73±0.79##參麥注射液組　19.03±0.72**19.13±0.95**20.77±0.90**透明質酸鈉組　18.52±1.03**19.51±1.45**20.88±1.44**

3.3 膝關節軟骨組織相關基因的表達

結果見表3。與正常對照組比較，新西蘭兔軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，參麥注射液組和透明質酸鈉組新西蘭兔軟骨組織中IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA均顯著降低（P＜0.05）。

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達Table 3 Expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cartilage in different groups（±s，n=8）

表3 各組軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達Table 3 Expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in cartilage in different groups（±s，n=8）

與正常對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05。

組別　IL-1β　IL-6　TNF-α正常對照組　1.00±0.46　1.00±0.51　1.00±0.54模型組　6.00±2.61##　1.96±1.03##　2.40±1.65##參麥注射液組　3.83±1.20*　1.17±0.34*　1.39±0.62*透明質酸鈉組　4.13±1.55*　1.30±0.47*　1.16±0.55*

4 討論

KOA是一種以膝關節滑膜增生、軟骨退行性變、繼發性骨質增生、骨贅形成為主要病理特征的關節疾病。目前圍繞KOA已展開了許多研究，細胞因子失衡、基質金屬蛋白酶（MMP）降解、生物力學改變等是常見的學說。研究表明［6］，炎性細胞因子升高是KOA的始發因素，并貫穿于疾病的整個過程。

IL-1β、IL-6、TNF-α是關節炎病理過程中促進軟骨基質降解和關節軟骨破壞的重要炎性細胞因子［7］。傅欣等［8］研究發現在兔骨性關節炎模型中，隨著時間延長關節軟骨損傷進行性加重，關節液中IL-1β和TNF-α水平呈高表達。黃金剛等［9］研究表明IL-1β能誘導軟骨細胞在短期內高表達MMP-13、Adamts-4和Adamts-5而直接降解細胞外基質。王玉彬等［10］研究表明在OA患者關節軟骨中，TNF-α不僅在表層，甚至在中、深層軟骨細胞中均呈高表達；在中、后期的病變軟骨中，IL-6在全層均有高表達，IL-6表達增多還將刺激MMP表達，導致大量軟骨基質降解，成纖維細胞膠原合成亦受阻，進一步加重軟骨損傷。

關節液由關節囊內層滑膜分泌，正常情況下起到營養、潤滑關節的作用。當發生關節炎時，關節液中炎性細胞因子水平升高，刺激MMP合成與分泌，介導軟骨基質降解，當破壞達到軟骨細胞層，關節液中的炎性細胞因子又誘導軟骨細胞分泌多種物質加速軟骨基質降解，并且激活軟骨細胞凋亡信號通路，導致KOA的進一步發展。因此下調炎性細胞因子水平，將可能有效抑制KOA發生和發展。

郭偉文等［11］通過實驗表明參麥注射液關節關節腔注射可通過降低關節液中的 TNF-α、IL-1β、MMP-3水平。郭玉海等［12］通過臨床試驗表明參麥注射液與透明質酸鈉均可有效降低關節液中NO水平，改善患膝關節功能，兩者療效無明顯差異。溫振杰等［13］通過臨床試驗證實參麥注射液與透明質酸鈉關節腔注射，均能明顯改善退行性關節炎癥狀和體征，且療效無明顯差別。然而，目前尚未有關于參麥注射液與透明質酸鈉治療膝骨關節炎療效的實驗研究。本實驗表明透明質酸鈉和參麥注射液均能顯著下調兔KOA關節液中炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，降低關節軟骨IL-1β、IL-6、TNF-α基因表達，并且這兩種藥物的作用差異無統計學意義。透明質酸鈉是治療KOA的常用藥物，通過關節腔注射補充外源性透明質酸鈉能起到潤滑關節、抗炎、修復軟骨創傷等多種作用。參麥注射液由紅參和麥冬提取而成，人參中含有多種人參皂苷，其中人參皂苷Rg1、Rb1、Rg3已證實具有抑制軟骨細胞凋亡、保護軟骨細胞外基質、延緩 KOA疾病進程的作用［1-2，14-16］。而麥冬皂苷類成分、高異黃酮衍生物也證實了具有抗炎活性［17］，但對于KOA作用的研究尚未有相關報道。因此，參麥注射液干預兔KOA模型可能是通過藥物中的人參皂苷類成分發揮主要作用，其通路機制有待進一步研究。

綜上所述，參麥注射液可調節關節液及軟骨組織IL-1β、IL-6、TNF-α表達，發揮保護關節軟骨、延緩KOA的作用，其療效與透明質酸鈉相當。

參考文獻：

［1］LEE J H，LIM H，SHEHZAD O，et al.Ginsenosides from Korean red ginseng inhibit matrix metalloproteinase-13 expression in articular chondrocytes and prevent cartilage degradation［J］.Eur J Pharmacol，2014，724：145-151.

［2］SO M W，LEE E，LEE H S，et al.Protective effects of ginsenoside Rg3 on human osteoarthritic chondrocytes［J］. Mod Rheumatol，2013，23（1）：104-111.

［3］余健，徐曉珍，顧利強，等.高效液相色譜-串聯質譜法同時測定參麥注射液中9種皂苷［J］.中華中醫藥學刊，2014，32（1）：71-74.

［4］方斌，劉文剛，趙自明，等.參麥注射液關節內注射治療家兔膝骨關節炎的實驗研究［J］.風濕病與關節炎，2013，2（8）：27-30.

［5］BAI，B，LI Y.Danshen prevents articular cartilage degeneration via antioxidation in rabbits with osteoarthritis ［J］.Osteoarthr Cartilage，2016，24（3）：514-520.

［6］康思寧，劉強.骨關節炎病理過程與關節軟骨特性的改變［J］.中華關節外科雜志（電子版），2007，1（4）：275-278.

［7］鄧廉夫.IL-1、TNF和IL-6與骨關節炎［J］.國外醫學（創傷與外科基本問題分冊），1996，17（2）：102-106.

［8］傅欣，林霖，張繼英，等.骨性關節炎兔關節軟骨、關節液細胞因子IL-1β和TNF-α變化的研究［J］.中國運動醫學雜志，2007，26（6）：709-713.

［9］黃金剛，童海駿，劉宏強，等.IL-1β和TNF-α對軟骨細胞基質降解的影響及相關機制研究［J］.上海交通大學學報（醫學版），2010，30（9）：1084-1089.

［10］王玉彬，陳安民，郭風勁，等.骨關節炎患者軟骨組織中TNF-α、TGF-β、IL-6、IL-9的表達變化及意義［J］.山東醫藥，2007，47（12）：11-12.

［11］郭偉文，夏雄智，鄧崇禮.參麥注射液關節腔注射對兔骨關節炎細胞因子影響的實驗研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，2010，18（7）：11-12.

［12］郭玉海，朱建林，林定坤，等.參麥液關節腔內注射對癥狀性膝關節骨性關節炎的近期臨床療效觀察［J］.中醫正骨，2006，18（10）：9-10.

［13］溫振杰，陳亮.關節腔注射療法治療膝骨性關節炎的臨床對比觀察［J］.遼寧中醫雜志，2010，37（S1）：117-119.

［14］HUANG Y，WU D，FAN W.Protection of ginsenoside Rg1 on chondrocyte from IL-1β-induced mitochondria-activated apoptosis through PI3K/Akt signaling［J］.Mol Cell Biochem，2014，392（1/2）：249-257.

［15］WANG W，ZENG L，WANG Z M，et al.Ginsenoside Rb1 inhibitsmatrixmetalloproteinase13throughdownregulating notch signaling pathway in osteoarthritis［J］. Exp Biol Med（Maywood），2015，240（12）：1614-1621.

［16］NA J Y，KIM S，SONG K，et al.Anti-apoptotic activity of ginsenoside Rb1 in hydrogen peroxide-treated chondrocytes：stabilization of mitochondria and the inhibition of Caspase-3［J］.J GINS RES，2012，36（3）：242-247.

［17］袁春麗，孫立，袁勝濤，等.麥冬有效成分的藥理活性及作用機制研究進展［J］.中國新藥雜志，2013，22（21）：2496-2502.

（責任編輯：幸建華）

中圖分類號：R285.6

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0339-05

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032203

收稿日期：2016-03-22

基金項目：廣東省科技廳社會發展領域科技計劃項目（2013B021800214）；廣東省中醫優勢病種突破項目（粵中醫函［2015］19號）

作者簡介：陳能（1987—），男，博士研究生，主要從事中醫藥治療骨關節病研究；通信作者：許學猛（1964—），男，主任醫師，主要從事中醫藥治療骨關節病研究，Email：xuxuemeng@163.com。

Effect of shenmai injection on the expression of IL-1β，IL-6 and TNF-α in rabbits with knee osteoarthritis

CHEN Neng1，2，YAO Nan3，XU Xuemeng1，LI Gang4，ZENG Deming1，2，CHEN Guocai1，2

（1.Guangdong Second Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou 510095，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Research and Development in Traditional Chinese Medicine，Guangdong Province Engineering Technology Research Institute of TCM，Guangzhou 510095，China；4.Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 518172，China）

AbstractObjective To study the therapeutic effect of shenmai injection in rabbits with knee osteoarthritis KOA and its potential mechanism.Methods KOA was induced in rabbits by anterior cruciate ligament transection ACLT .Then shenmai and hyaluronic acid were administrated by intra-articula injection.After four weeks the rabbits were killed and synovial fluid and cartilage were collected.The levels of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid were detected by ELISA.The expression of IL-1β IL-6 and TNF-α mRNA in cartilage was detected by real-time quantitative PCR.Results Compared with the normal control group the expressions of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid and cartilage were significantly increased in the model group P＜0.01 .However the expressions of these cytokines in synovial fluid and cartilage were

網絡出版時間：2016-05-30 10：40 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1040.004.html

obviously decreased in model mice when treated with shenmai and hyaluronic acid P＜0.05 .There was no statistical difference between shenmai group and hyaluronic acid group P＞0.05 .Conclusion Shenmai injection has a protective effect on rabbit knee articular cartilage which may be related to down-regulation of the expression of IL-1β IL-6 and TNF-α in synovial fluid and cartilage.

Key wordsrabbits with knee osteoarthritis shenmai injection interleukin-1β interleukin-6 tumor necrosis factor-α