基于超高壓液相色譜-高分辨多級質譜聯用技術的中藥淡竹葉化學成分分析

潘智然，王騰華，朱首倫，任之堯，張靖，2

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基于超高壓液相色譜-高分辨多級質譜聯用技術的中藥淡竹葉化學成分分析

潘智然1，王騰華1，朱首倫1，任之堯1，張靖1，2

（1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東 廣州 510120；2.廣東省中醫藥科學院，廣東 廣州510006）

摘要：目的建立基于超高壓液相色譜-電噴霧-高分辨多級質譜聯用技術（UHPLC-ESI-HR MSn）的中藥淡竹葉醇提物的化學成分快速定性分析研究方法。方法液相采用Phenomenex kinetex C18色譜柱，乙腈-0.1%（體積分數）甲酸系統梯度洗脫，質譜采用電噴霧-離子阱-靜電場軌道阱組合質譜技術，以負離子模式采集，線性離子阱內碰撞誘導解離獲取多級質譜數據，軌道阱內測定高分辨質譜數據。將獲取的對照成分的質譜裂解數據、液相和多維質譜信息進行分析總結并進行在線結構解析。結果 本法對淡竹葉醇提物中的主要成分峰分離良好，根據精確分子量和二級質譜碎片信息，結合對照品質譜裂解途徑，從淡竹葉中快速鑒定了21個化學成分。結論本方法具有高效、高靈敏度的檢測優勢，能較全面地反映出淡竹葉醇提物的化學成分，可實現黃酮碳苷、黃酮及酚酸類等不同結構類型化合物鑒別，為深入闡明中藥淡竹葉藥效物質基礎及其質量標準研究提供高效可靠的檢測手段。

關鍵詞：淡竹葉；液質聯用；黃酮碳苷；化學成分

網絡出版時間：2016-05-24 15：28 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160524.1528.001.html

中藥淡竹葉為禾本科（Gramineae）淡竹葉屬植物淡竹葉（Lophatherum gracile Brongn.）的干燥莖葉，主產于湖南、廣東、安徽、浙江、福建等地，在1977年以來的歷版《中國藥典》中均有收載，為嶺南地區常用道地藥材［1-2］。淡竹葉味甘性寒，具清熱、除煩、利尿等功效，多用于熱病心煩、口舌生瘡、牙齦腫痛、尿路炎癥等癥，民間常用于治療呼吸道感染所引起的感冒、發熱等疾病［3］。

現代藥理學研究顯示，淡竹葉具解熱、利尿、抗菌、抗腫瘤、升高血糖等多種藥理作用［4-6］，為衛生部公布的藥食兩用中藥之一，在大健康產品領域如醫藥、保健品、功能性飲料、食用品、天然防腐劑等多方面均有較廣泛的應用前景。前期的化學成分研究顯示［7-8］，淡竹葉中含有黃酮、酚酸及三萜類等多種成分，其中黃酮碳苷類為其主要化學結構類型。藥理試驗表明，6位單糖取代的黃酮碳苷類成分具有顯著的體外抗呼吸道合胞病毒（RSV）活性［9］。

液相色譜-質譜聯用技術（液質聯用，LC-MS）具有樣品預處理簡單、分析速度快、靈敏度高及專屬性高等特點。近年來，隨著對中藥復雜體系分析要求的不斷提高及液質聯用技術的不斷更新發展，LCMS在中醫藥多研究領域得到廣泛應用。由線性離子阱（linear ion trap quadrupole，LTQ）和靜電場軌道離子阱（orbitrap）結合而形成的組合式質譜儀是近年來質譜技術發展的杰出代表，具有卓越的分辨率、多種掃描和碎裂組合［10］，可同時實現母、子離子的高分辨采集及多級質譜碎裂信息獲取，不僅可以鑒定已知化合物，還可以通過不同化合物的裂解規律及特征碎片離子來推斷未知化合物。該組合質譜技術可為中藥小分子化學成分的鑒定及分析提供更多、更準確的信息［11-12］，并能有效地指導中藥化學成分，尤其是微量未知成分的選擇性提取和分離試驗。

本文采用超高壓液相色譜-電噴霧-高分辨多級質譜聯用技術（UHPLC-ESI-HR MSn）技術開展淡竹葉的化學成分的質譜分析研究，建立快速、高效、準確的質譜分析方法，實現黃酮碳苷、黃酮及酚酸類等不同結構類型化學成分的快速識別，為中藥淡竹葉藥材質量研究、新藥研發提供有利的分析依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

液相采用Thermo Accela超高壓液相色譜儀（美國Thermo-fisher公司），由四元高壓泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器組成。液相部分通過電噴霧離子源（ESI）與LTQ-Orbitrap XL線性離子阱軌道離子阱組合式質譜儀連接（美國Thermo-fisher公司），數據采集及處理軟件為Xcalibur 2.1（美國Thermo-fisher公司）。

AB135-S型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），3K15高速冷凍離心機（德國sigma公司），AS 20500A超聲波清洗儀（頻率40 Hz，功率250 W，天津奧特賽恩斯儀器有限公司），步琪R-210型旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司），DK-S26電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

淡竹葉藥材購自廣東省中醫院藥房，經廣州中醫藥大學第二臨床醫學院黃志海主任中藥師鑒定為禾本科淡竹葉屬植物淡竹葉 Lophatherum gracile Brongn.的干燥莖葉，樣品現保存于廣東省中醫院中藥制劑研究室樣品室。

對照品葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素為本實驗室從淡竹葉醇提物中分離得到（質量分數均高于95%），其結構經MS、NMR、UV等波譜學確認。

高效液相色譜級甲醇、乙腈（美國Sigma公司）；質譜級甲酸（美國Thermo-fisher公司）；超純水由Milli-Q制水機（Millipore公司）制得。

2 方法與結果

2.1 對照品、供試品溶液的制備

分別稱取葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素對照品約0.10 mg，分別用70%（體積分數，下同）甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜濾過，制得上述4種對照品質量濃度分別為10 μg/mL的各對照品溶液。

精密稱取淡竹葉粉末（過60目篩）2.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，用70%甲醇溶液50 mL加熱回流2 h，濾過，濃縮至干。用70%甲醇溶解轉移，并定容于25 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液為供試品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；流動相為0.1%（體積分數，下同）甲酸（A）、乙腈（B）梯度洗脫：0～10 min（5%B→26%B），10～18 min（26%B→42%B），18～22 min （42%B→90%B）；柱溫：25℃；流速：300 μL/min；進樣體積：2 μL。

2.3 質譜條件

采用電噴霧離子源負離子模式，離子源參數設置如下：鞘氣（N2）=3.033 8×105Pa，輔助氣（N2）3.447 5×104Pa，噴霧電壓2.7 kV，毛細管溫度350℃，管透鏡電壓-130 V，毛細管電壓-38 V；樣品先采用高分辨質譜全掃描，質量范圍為m/z 150～1 500；分辨率為FS 30 000，MS/MS 6 000；二級質譜采用動態數據依賴性掃描，碰撞能量設為35%，多級質譜選取上一級最高峰離子掃描碰撞誘導解離碎片。

2.4 條件優化

2.4.1 提取溶劑的選擇 針對淡竹葉化學成分特點，對提取溶劑進行選擇。分別考察了體積分數50%、70%及100%甲醇的提取效果，結果發現70%甲醇獲得的色譜峰峰容量最大，故采用70%甲醇回流提取。

2.4.2 洗脫條件的優化 分別考察了甲醇-水、乙腈-水系統的洗脫效果，結果顯示乙腈洗脫時效果優于甲醇，各色譜峰的分離效果更佳。在流動相中加入0.1%甲酸可提高質譜信號響應，并改善峰形，故選用乙腈-0.1%甲酸為流動相梯度洗脫。見圖1。

A.乙腈-0.1%甲酸系統；B.甲醇-0.1%甲酸系統；C.乙腈-0.1%乙酸系統。圖1 3種不同流動相下淡竹葉醇提物的LC-MS總離子流圖Figure 1 The LC-MS total ion chromatograms of the ethanolic extract from L.gracile in three different chromatographic conditions

2.5 淡竹葉醇提物的測定

按“2.1”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.2”和“2.3”項下色譜及質譜條件，用 UHPLCLTQ-Orbitrap-MSn法對淡竹葉中化學成分進行定性分析，得供試品溶液的（-）ESI-MS總離子流（TIC）圖見圖2，觀察可得知淡竹葉醇提物各色譜峰之間實現較好的分離。通過檢測得到的各化學成分峰的保留時間和精確分子量，并結合二級質譜裂解碎片信息及與對照品、數據庫及相關文獻數據比對其中的21個化學成分峰進行確認，結果見表1。

圖2　淡竹葉醇提物的（-）ESI-MS總離子流圖Figure 2 The total ion chromatogram of the ethanolic extract from L.gracile in negative ion mode

2.6 黃酮碳苷對照品質譜裂解規律的研究

采用質譜直接進樣方法（direct infusion），分別對4種黃酮碳苷成分葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素在LTQ-Orbitrap質譜中的裂解規律進行研究。結果表明黃酮碳苷類成分在負離子質譜模式下均能形成穩定的［M-H］-準分子離子峰，進一步對該離子峰進行MS2-MS4裂解發現，4種黃酮碳苷成分質譜裂解途徑具有高度相似性和特征性，并能和一般黃酮苷類成分明顯區別，可以用于黃酮碳苷類成分的分析和鑒定，以下將以葒草苷為例，具體闡述黃酮碳苷類成分的質譜裂解規律。

葒草苷在LTQ-Orbitrap高分辨多級質譜中形成m/z 447.092 0（C21H19O11，Δ=-0.42）的［M-H］-準分子離子峰，進一步碎裂形成2個非常明顯的子離子m/z 327.050 0（C17H11O7，Δ=0.28）、357.060 4 （C18H13O8，Δ=-0.21），高分辨質譜顯示分別失去C4H8O4和C3H6O3的中性分子，推測該裂解發生在糖殘基上。同時觀察到微弱的連續失去3個H2O的中性分子形成了 m/z 429.080 4、411.070 7、393.060 2碎片離子。其中m/z 327.050 0的基峰在MS3質譜中進一步碎裂形成m/z 299.055 1（C16H11O6，Δ=0.55）和284.031 7（C15H8O6，Δ=0.71）的2個主要子離子，其中m/z 299為黃酮母核中脫去CO的碎片離子，而m/z 284為碳苷鍵發生均裂形成的奇電子離子碎片（odd electron，OE）。在m/z 299的MS4譜中，進一步于黃酮母核內部發生一般黃酮類特征碎裂脫去CO2形成m/z 255.065 6的碎片。見圖3。

表1 淡竹葉中21個主要化學成分LC-ESI-MS/MS數據Table 1 LC-ESI-MS/MS data of 21 major compounds from L.gracile

圖3　黃酮碳苷的質譜裂解途徑（葒草苷）Figure 3 The MS fragment pathways of the flavone C-glycoside（orientin）

異葒草苷的苷元結構與異葒草苷一致，僅為碳苷的取代不同，如上所述，黃酮碳苷的特征裂解主要發生在碳苷內部，因此二者的特征質譜等同。同理，牡荊素、異牡荊素的特征質譜主要發生在糖的內部，均在二級質譜形成特征的［M-H-C3H6O3（90）］-、［M-H-C4H8O4（120）］-等碎片離子，由于質譜裂解途徑相同，不再一一贅述。

2.7 黃酮碳苷類成分ESI-MS/MS分析

目前從淡竹葉中分離得到的黃酮碳苷主要分為以下幾類：類型1，C-6位或C-8位單糖碳苷取代，如化合物11～13，16～18；類型2，7-O位單糖氧苷取代同時C-6位或C-8位單糖碳苷取代，如化合物10；類型3，C-6位糖醛酸連接單糖鏈碳苷取代，如化合物9、14及19。其中，通過與對照品保留時間和質譜行為的比較，化合物11、12、16、17分別鑒定為異葒草苷、葒草苷、牡荊素、異牡荊素。

類型1中黃酮碳苷類的負離子模式二級質譜圖中，可觀察到［M-H-C4H8O4］-、［M-H-C3H6O3］-的黃酮碳苷特征峰，此外還觀察到［M-H-78］-、［MH-60］-及［M-H-18］-的碎片離子。這些離子來源于糖環的開環反應，是這一類化合物的特征碎片離子，其相對豐度遠高于碳苷鍵裂解形成的碎片離子，黃酮碳苷的C—C鍵鍵能較氧苷中的C—O鍵較高，所以碳苷類化合物以糖環內部斷裂的裂解方式為主［13］。

類型2中化合物10的高分辨質譜給出準分子離子峰m/z 579.132 8［M-H］-（C26H28O15），MS2譜圖給出m/z 489、459、417、399、357及327等碎片峰，分別為碳苷糖環開環及脫去氧苷的碎裂產物，其碎裂方式見圖4。結合其精確分子量和文獻報道，推測化合物10為木犀草素7-O-β-D-葡萄糖基-6-C-α-L-阿拉伯糖苷。

類型3中化合物9，14和19的MS2譜圖中，首先均可觀察到2個基峰，分別為m/z 447、417、401 ［M-H-176］-及m/z 429、399、383［M-H-194］-，為脫去六碳糖醛酸（葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸）的特征碎片。此外，化合物9的MS2譜圖中可觀察到m/z 357［M-H-176-90］-、m/z 327［M-H-176-120］-及m/z 285［M-H-176-162］-等峰，為葡萄糖開環裂解碎片。化合物14和19的MS2譜圖中可觀察到m/z 357、341［M-H-176-60］-、m/z 327、311［M-176-90］-及m/z 285、269［M-H-176-132］-等峰，為五碳糖阿拉伯糖的開環裂解碎片。經與文獻［9］數據對照，推斷化合物19為芹菜素6-C-β-D-半乳糖醛酸基（1→2）-α-L-阿拉伯糖苷，化合物9和14尚未見文獻報道。

2.8 羥基酚酸類成分的ESI-MS/MS鑒定

據文獻報道，淡竹葉含有酚酸類成分，如綠原酸、咖啡酸、香草酸等［3］。化合物1、3和5均給出準分子離子峰 m/z 353.09［M-H］-及精確分子式C16H18O9，提示為同分異構體，結合數據庫初步判定為單咖啡酰奎尼酸（caffeoyl-quinic acid，CQA）類成分，三者的MS2譜圖分別給出基峰為m/z 191、191 和173，表明化合物1和3易脫去單咖啡酰基形成奎尼酸，化合物5易從4位羥基位置斷裂形成烯醇基結構（碎裂方式見圖5），通過與對照品比對確定化合物3為3-CQA（綠原酸），5-CQA與3-CQA的二維結構相同，但立體構型上存在較大差別，體現在質譜中的差異為二者的二級碎裂信號相似，但在相對豐度上有明顯差異，其中5-CQA的m/z 179碎裂信號遠高于3-CQA。4-CQA與3-CQA的極性相近，但在反相色譜中4-CQA的保留時間更長［14］，結合文獻［15］數據，確定化合物1、5分別為5-CQA（新綠原酸）和4-CQA（隱綠原酸）。

圖4　化合物10的MS2質譜圖Figure 4 MS2spectra of compound 10

圖5　化合物1，3和5的MS2質譜圖及主要裂解途徑Figure 5 MS2spectra of compound 1，3，5 and their major fragmentation pathways

化合物2、7和 8的準分子離子峰均為 m/z 337.09［M-H］-（C16H17O8），其二級譜基峰分別為m/z 163、163和173，其裂解途徑與單咖啡酰奎尼酸成分相似，經與文獻［16］數據對照，推斷其結構分別為 5-pCoQA、3-pCoQA和 4-pCoQA（p-coumaroylquinic acid，對香豆酰奎尼酸）。此外，可檢測到微量的游離羥基酚酸類成分，如咖啡酸（化合物6），其MS2譜圖中可看到脫CO2的離子m/z 135。

3 討論

與正離子模式比較，淡竹葉供試品溶液在負離子模式下所得成分峰較多，信號響應佳，故采用以負離子檢測的分析模式，能實現大多數化合物的結構確證。在ESI負離子模式下，各化學成分峰高分辨一級質譜圖主要以［M-H］-準分子離子峰存在，依靠ESI-MSn圖譜可獲取有效的結構碎裂信息。

結果顯示，淡竹葉醇提物中主要含有羥基酚酸類、黃酮碳苷類及其他黃酮類成分。高分辨質譜給出的精確分子式信息，結合多級質譜提供的特征碎片離子及裂解途徑分析策略，為淡竹葉藥材的物質基礎研究、質量控制提供了快速、準確的檢測手段，并為進一步尋找微量成分提供重要的參考。

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（責任編輯：劉曉涵）

中圖分類號：R284.1

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0300-07

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016031802

收稿日期：2016-03-18

基金項目：廣東省中醫藥管理局建設中醫藥強省科研項目（20152136）；國家自然科學基金（81402887）

作者簡介：潘智然（1983—），男，主管藥師，從事中藥材質量控制研究，Email：1055478879@qq.com；通信作者：張靖（1983—），女，博士，助理研究員，從事中藥藥效物質基礎及質量控制研究，電話：020-39318571，Email：ginniezj@163.com。

Identification of chemical constituents from Lophatherum gracile Brongn.by UHPLC-LTQ-Orbitrap HR MSn

PAN Zhiran1，WANG Tenghua1，ZHU Shoulun1，REN Zhiyao1，ZHANG Jing1，2
（1.The Second College of Clinic Medicine，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China；2.Guangdong Province Institute of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China）

AbstractObjective To establish a method for qualitative analysis of chemical components from Lophatherum gracile Brongn.by UHPLC-ESI-HR MSnspectrometry.Methods A Phenomenex kinetix C18column and a gradient elution of acetonitrile-0.1%formic acid were applied for UHPLC separation.An orbitrap mass analyzer combined with a linear ion trap were used for high resolution mass spectrometry and subsequent collision-induced dissociation.Results High separation efficiency was achieved with UHPLC on constituents from L.gracile.According to the high-resolution mass information and MS/MS fragmentation behaviors 21 compounds were tentatively identified.Conclusion This work set a good example for rapid qualitative analysis of different classes of constituents from L.gracile which might be helpful for its further phytochemical study and quality control.

Key wordsLophatherum gracile UHPLC-ESI-HR MSnflavone C-glycosides chemical constituents