樹突狀細胞多價核酸疫苗抗血吸蟲感染作用及機制研究

沈定文,羅金萍,王若愚,許培培,戴　波,余軍林,李雍龍

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樹突狀細胞多價核酸疫苗抗血吸蟲感染作用及機制研究

沈定文1,羅金萍1,王若愚1,許培培1,戴波1,余軍林1,李雍龍2

1.湖北科技學院基礎醫學院,咸寧437100;2.華中科技大學同濟醫學院,武漢430030

摘要：目的探討基因轉染對樹突狀細胞(DC)功能的影響及DC多價核酸疫苗抗血吸蟲感染作用及機制。方法利用脂質體介導的基因轉染技術將Sj26、Sj23和Sj14基因分別轉染DC，流式細胞術(FCM)檢測DC攝取抗原能力，混合淋巴細胞反應(MLR)檢測DC對同種異體T淋巴細胞的刺激作用。Sj26、Sj23和Sj14基因轉染DC分別和聯合免疫BALB/c小鼠3次，末次免疫2周后，每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴40條，小鼠感染血吸蟲6周后，計數成蟲和蟲卵。ELISA法檢測血清特異性IgG、血清干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-4(IL-4)及脾淋巴細胞培養上清IFN-γ、IL-4水平，噻唑藍(MTT)法檢測脾淋巴細胞的增殖。結果與真核表達載體pcDNA3轉染DC和未處理DC相比較，基因轉染DC攝取抗原的熒光強度明顯降低(P<0.01)，對同種異體T淋巴細胞的刺激指數明顯升高(P<0.01)。各免疫組小鼠誘導的減蟲率和減卵率均高于對照組(P<0.01)，而基因轉染DC聯合免疫組小鼠抗血吸蟲感染作用高于單一基因轉染DC免疫組(P<0.001)。基因轉染DC免疫組小鼠末次免疫2周后血清特異性IgG水平較免疫前顯著升高(P<0.05)，血清IFN-γ水平明顯升高(P<0.01)，而血清IL-4的水平無明顯變化。與對照組比較，基因轉染DC免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后培養上清IFN-γ水平顯著增高，IL-4水平顯著降低，刺激指數(SI)顯著增高(P<0.001)。結論基因轉染能促進DC的成熟，增強DC的活性，DC多價核酸疫苗可增強抗血吸蟲感染作用，其作用機制以Th1型免疫應答為主。

關鍵詞：日本血吸蟲；樹突狀細胞；多價核酸疫苗；保護性免疫

Supported by the Natural Science Foundation of Hubei Province (No. 2012FFC01501), the Research Project of Hubei Provincial Department of Health (No. XF2012-13), and the Hubei Province Training Programs of Innovation and Entrepreneurship for Undergraduates (No. 201310927009)

我國湖沼地區及大山區血吸蟲病疫情目前仍然十分嚴峻，成為亟待解決的公共衛生問題之一。隨著免疫學和分子生物學技術的快速發展，核酸疫苗在血吸蟲病防治方面具有廣闊的前景，但是目前血吸蟲疫苗候選分子均難以穩定達到WHO要求的50%的抗感染作用，如何增強核酸疫苗的免疫效果便成為當前血吸蟲疫苗研究的焦點[1]。

樹突狀細胞(DC)在免疫應答的誘導中發揮關鍵作用，是具有最強提呈抗原功能的抗原提呈細胞(APC)。近年來DC在抗腫瘤、感染、移植免疫以及自身免疫病等方面得到了廣泛的應用[2-5]。我們自2002年開始探討以DC為載體，將Sj26、Sj23和Sj14三種血吸蟲候選抗原編碼基因分別轉染DC，單獨或聯合免疫小鼠誘導抗血吸蟲感染作用，并通過體內、體外實驗研究其作用機制[6-7]。

1材料與方法

1.1細胞株與小鼠DC細胞株MTSC4(北京大學醫學部陳慰峰教授惠贈)；6～8周齡、雌性BALB/c小鼠(武漢市生物制品研究所)。

1.2Sj26、Sj23、Sj14基因轉染DC制備PCR方法擴增Sj26、Sj23、Sj14基因片段，定向克隆至真核表達載體pcDNA3。參照文獻[6]，按LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogen公司)使用說明書，利用脂質體介導的基因轉染技術將Sj26、Sj23、Sj14基因分別轉染DC，常規方法培養傳代。利用RT-PCR、SDS-PAGE和間接免疫熒光試驗檢測Sj26、Sj23和Sj14在DC中的表達。

1.3DC攝取抗原能力檢測利用流式細胞術(FCM)分別檢測Sj26、Sj23和Sj14基因轉染DC攝取FITC標記羊抗鼠IgG的熒光強度，同時設pcDNA3轉染DC和未處理DC對照。

1.4DC對同種異體T淋巴細胞刺激作用的檢測

取正常BALB/c小鼠脾淋巴細胞作為反應細胞，混合淋巴細胞反應(MLR)分別檢測Sj26、Sj23、Sj14、pcDNA3轉染DC和未處理DC對淋巴細胞的刺激指數(SI)，同時設RPMI-1640空白對照。SI=實驗組A492值/對照組A492值。

1.5動物免疫與感染BALB/c小鼠80只，隨機分為8組。免疫方案為，Sj26-Sj23-Sj14(A組)、Sj26-Sj23(B組)、Sj26(C組)、Sj23(D組)、Sj14基因轉染DC(E組)分別經耳廓注射免疫BALB/c小鼠，免疫3次，間隔2周，同時設pcDNA3轉染DC(F組)、未處理DC(G組)和RPMI-1640對照(H組)。感染方案為末次免疫2周后，每只小鼠感染日本血吸蟲尾蚴40條。

1.6小鼠血清特異性IgG檢測采用ELISA法進行，酶標儀測定吸光度(A491)值。

1.7抗血吸蟲感染作用

1.7.1減蟲率小鼠感染血吸蟲6周后，門靜脈灌注沖洗收集血吸蟲成蟲并計數。按公式計算減蟲率：減蟲率(%)=(對照組成蟲均數-免疫組成蟲均數)/對照組成蟲均數×100%。

1.7.2減卵率取小鼠肝臟，稱重，5%KOH 10 mL消化過夜，取0.1 mL計數血吸蟲蟲卵。按公式計算減卵率：減卵率(%)=(對照組每雌蟲蟲卵均數-免疫組每雌蟲蟲卵均數)/對照組每雌蟲蟲卵均數×100%。

1.8小鼠血清IFN-γ和IL-4檢測按照IFN-γ和IL-4檢測試劑盒(BD Biosciences pharmingen公司)使用說明書進行，酶標儀測定吸光度(A450)值。

1.9脾淋巴細胞培養上清IFN-γ和IL-4檢測ELISA法分別檢測小鼠脾淋巴細胞經SEA(10 μg/mL)和ConA(5 μg/mL)刺激后IFN-γ和IL-4水平，同時設RPMI-1640空白對照。

1.10脾淋巴細胞增殖噻唑藍(MTT)法檢測SEA(10 μg/mL)和ConA(5 μg/mL)刺激對脾淋巴細胞的增殖情況，同時設RPMI-1640空白對照，酶標儀測定吸光度(A560)值。按公式計算SI：SI=刺激孔A560均值/對照孔A560均值。

1.11統計分析數據分析采用SPSS 16.0版本F檢驗和t檢驗。

2結果

2.1Sj26、Sj23和Sj14在DC中的表達RT-PCR、SDS-PAGE和間接免疫熒光法檢測結果顯示，Sj26、Sj23和Sj14基因轉染成功并在DC中獲得表達(圖1-3)。

1:Product of pcDNA3-Sj26 transferred DC；2: Product of pcDNA3-Sj23 transferred DC；3: Product of pcDNA3-Sj14 transferred DC；4: Product of pcDNA3 transferred DC； 5: Product of untreated DC; 6: DNA marker.

圖1RT-PCR檢測mRNA的表達

Fig. 1Expression of mRNA detected by RT-PCR

1: Product of pcDNA3-Sj26 transferred DC； 2: Product of pcDNA3-Sj23 transferred DC；3: Product of pcDNA3-Sj14 transferred DC；4: Product of pcDNA3 transferred DC；5: Product of untreated DC；6: Protein marker.

圖2基因轉染DC表達產物的SDS-PAGE分析

Fig. 2SDS-PAGE analysis of expression products of gene transferred DC

1: pcDNA3-Sj26 transferred DC； 2: pcDNA3-Sj23 transferred DC； 3: pcDNA3-Sj14 transferred DC；4: pcDNA3 transferred DC；5: untreated DC.

圖3間接免疫熒光試驗檢測Sj26、Sj23和Sj14在DC中的表達(200×)

Fig. 3Expression of Sj26、Sj23 and Sj14 in DC detected by indirect immunofluorescence assay(200×)

2.2DC攝取抗原能力與pcDNA3轉染DC和未處理DC相比較，基因轉染DC攝取抗原的熒光強度明顯降低(P<0.01)，表明基因轉染后，促進了DC的成熟，其攝取抗原能力明顯降低(圖4)。

圖4　基因轉染DC攝取抗原的能力

Fig. 4The ability of antigen absorbing of S. japonicum encoding gene transferred DC

2.3DC對同種異體T淋巴細胞的刺激作用基因轉染DC對同種異體T淋巴細胞的SI明顯高于pcDNA3轉染DC和未處理DC(P<0.01)，表明基因轉染后，增強了DC的生物學活性(圖5)。

圖5　基因轉染DC對同種異體T淋巴細胞的刺激作用

Fig. 5The effect of gene transferred DC on stimulating allogenetic T lymphocyte

2.4抗血吸蟲感染作用各免疫組小鼠抗血吸蟲感染作用與RPMI-1640對照組相比較，差異有統計學意義(P<0.01)，而基因轉染DC聯合免疫組小鼠抗血吸蟲感染作用明顯高于單一基因轉染DC免疫組(P<0.001)(表1)。

表1　基因轉染DC免疫BALB/c小鼠抗血吸蟲感染作用

Note:★Compared with group A,P<0.001；▲Compared with group B,P<0.001；◆Compared with group A,P>0.05.

2.5血清IgG水平基因轉染DC免疫小鼠后，血清IgG水平較免疫前明顯升高(P<0.05)。基因轉染DC聯合免疫組小鼠IgG水平明顯高于單一基因轉染DC免疫組(P<0.01)。感染6周后，各組小鼠血清IgG水平差異無統計學意義(圖6)。

圖6　各組BALB/c小鼠血清IgG水平

Fig.6The level of IgG in BALB/c mice sera of each group

2.6血清IFN-γ水平BALB/c小鼠經基因轉染DC免疫后，血清IFN-γ含量明顯升高(與免疫前相比較，P<0.01)，且明顯高于pcDNA3轉染DC和未處理DC對照組(P<0.01)，基因轉染DC聯合免疫組小鼠血清IFN-γ水平明顯高于單一基因轉染DC免疫組(與Sj26相比，P<0.05，與Sj23和Sj14相比較，P<0.01)(圖7)。

2.7血清IL-4水平各組BALB/c小鼠免疫前、后血清IL-4水平差異無統計學意義(圖8)。

2.8脾淋巴細胞培養上清IFN-γ水平與RPMI-1640對照組相比較，基因轉染DC免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后培養上清IFN-γ水平顯著增高(P<0.001)。基因轉染DC聯合免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后培養上清IFN-γ水平明顯高于單一基因轉染DC免疫組(P<0.01)(圖9)。

圖7　各組BALB/c小鼠血清IFN-γ水平

Fig.7The level of IFN-γ in BALB/c mice sera of each group

圖8　各組BALB/c小鼠血清IL-4水平

Fig. 8The level of IL-4 in BALB/c mice sera of each group

圖9　各組BALB/c小鼠脾淋巴細胞培養上清IFN-γ水平

Fig. 9The level of IFN-γ in BALB/c mice spleen lymphocytes culture supernatant of each group

2.9脾淋巴細胞培養上清IL-4水平與RPMI-1640對照組比較，基因轉染DC免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后培養上清IL-4水平顯著降低(P<0.001)。基因轉染DC聯合免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后培養上清IL-4水平低于單一基因轉染DC免疫組(與Sj26相比，P<0.05，與Sj23和Sj14相比較，P<0.01)(圖10)。

圖10　各組BALB/c小鼠脾淋巴細胞培養上清IL-4水平

Fig.10The level of IL-4 in BALB/c mice spleen lymphocytes culture supernatant of each group

2.10脾淋巴細胞增殖與RPMI-1640對照組相比較，基因轉染DC免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后的SI顯著升高(P<0.001)，而pcDNA3轉染DC和未處理DC組差異無統計學意義。基因轉染DC聯合免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后的SI明顯高于單一基因轉染DC免疫組(P<0.01)(圖11)。

圖11　各組BALB/c小鼠脾淋巴細胞SI

Fig.11The SI of spleen lymphocytes in BALB/c mice of each group

3討論

隨著免疫學和分子生物學技術的不斷發展，用疫苗預防血吸蟲病已成為可能。目前國際上公認有發展前途的血吸蟲疫苗候選抗原有6種，即谷胱苷肽S轉移酶(GST)，血吸蟲97 kDa副肌球蛋白(Sm97)，磷酸丙糖異構酶(TPI)，照射疫苗5(IRV5)，Sm37甘油磷酸脫氫酶(GAPDH)和Sm14脂肪酸結合蛋白(FABP)。雖然血吸蟲疫苗的研究工作取得了初步的進展，但真正應用于臨床還需進行更多的研究，目前僅有GST進入臨床I期試驗[1]。

現有的血吸蟲疫苗候選分子抗感染作用有限，探索新的疫苗候選抗原，改進免疫方法和途徑等以提高免疫作用，其意義顯得尤為重要而迫切。DC是體內功能最強的抗原提呈細胞，在免疫應答的誘導中發揮關鍵作用，能有效活化未致敏T淋巴細胞。抗原提呈效率高，少量抗原和少量DC便足以激活T淋巴細胞，核酸疫苗若能以DC為載體可望獲得良好的免疫效果。

Schraml等(2015)和Mildner等(2014)研究證實，未成熟DC具有較強的抗原內吞及加工處理能力，當DC受到某些因子(如TNF-α、LPS、IL-1β等)刺激或攝取抗原后，可分化成熟。成熟DC低表達與吞噬有關的受體，高表達MHCⅡ、CD86、CD80、CD40、CD54等分子，特征性標志主要是CD83和CD25，其攝取、加工抗原的能力反而降低，而抗原提呈能力和刺激T淋巴細胞的作用增強[8-9]。本實驗結果與pcDNA3轉染DC和未處理DC相比較，基因轉染DC攝取抗原的熒光強度明顯降低，對T淋巴細胞的SI明顯高于pcDNA3轉染DC和未處理DC，表明基因轉染DC后促進了DC的分化成熟，增強了DC的生物學活性。

血吸蟲抗原成分復雜多樣，感染后的保護性免疫作用機制目前尚不完全清楚，迄今為止，單價抗感染疫苗候選分子誘導的抗感染作用很少超過50%。將含有不同抗原基因的質粒混合起來進行聯合免疫的多價核酸疫苗，可綜合各種核酸疫苗的協同作用，刺激機體有效的免疫應答，誘導宿主產生更完全的抗感染作用。本實驗結果基因轉染DC聯合免疫組小鼠誘導的抗感染作用明顯高于單一基因轉染DC免疫組，DC多價核酸疫苗聯合免疫可協同增強抗日本血吸蟲感染作用。

蟲卵是血吸蟲病的主要致病因子，所致的蟲卵肉芽腫和纖維化是血吸蟲病的主要病變，蟲卵肉芽腫的形成是宿主對致病因子的一種免疫應答。Pearce等研究證實，小鼠血吸蟲病的免疫病理與Tp型免疫應答有關，而特異性抗原誘導宿主的抗感染作用則與Th1型免疫應答有關[10]，蟲卵大量沉積前應用Th1型免疫應答為主的疫苗加以干預，在誘導抗血吸蟲感染方面有極其重要的作用。本實驗結果小鼠經基因轉染DC免疫后血清特異性IgG、IFN-γ明顯升高，而血清IL-4無明顯變化，與RPMI-1640對照組比較，基因轉染DC免疫組小鼠脾淋巴細胞經ConA和SEA刺激后IFN-γ水平顯著增高，IL-4水平顯著降低，SI顯著增高，表明Th1型免疫應答在DC多價核酸疫苗誘導的抗日本血吸蟲感染中起主要作用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.017

中圖分類號：R532.21

文獻標識碼：B

文章編號：1002-2694(2016)04-0406-06

收稿日期：2015-07-17修回日期：2015-12-15

Protective immunity and mechanism of dendritic cell multivalent nucleic acid vaccine against infection of Schistosoma japonicum

SHEN Ding-wen1,LUO Jin-ping1,WANG Ruo-yu1,XU Pei-pei1,DAI Bo1,YU Jun-lin1,LI Yong-long2

(1.BasicMedicalCollege,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning437100,China;2.TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China)

Abstract：To study the effect of gene transfer on the functions of dendritic cell (DC) and protective immunity and mechanism of DC multivalent nucleic acid vaccine against infection of Schistosoma japonicum, DCs were transfected with recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3-Sj26, pcDNA3-Sj23 and pcDNA3-Sj14. The ability of DC to absorb antigen was determined by flow cytometry (FCM). The mixed lymphocyte reaction (MLR) was used to detect the effect of gene transferred DC on stimulating allogenetic T lymphocyte. BALB/c mice were immunized three times with Sj26, Sj23 and Sj14 gene transferred DC, alone or combination, and infected with 40 cercariae of S. japonicum per mouse 2 weeks after the last immunization. The number of adult worm and the egg number in liver were calculated six weeks after infecting. ELISA was used to detect the levels of specific IgG, IFN-γ and IL-4 in sera from each mice group. The level of IFN-γ and IL-4 in the culture supernatant of spleen lymphocytes stimulated with soluble egg antigen (SEA) and ConA were quantified by ELISA. The proliferation of spleen lymphocytes were measured by the method of MTT. Compared with pcDNA3 transferred DC and untreated DC, the fluorescence intensity of antigen absorbing decreased significantly in S. japonicum encoding gene-transferred DC (P<0.01), and the stimulating index (SI) increased significantly (P<0.01). The rate of worm reduction and egg reduction in each group of immunization were higher than that of control group (P<0.01), while protective immunity induced by gene transfer DC were significantly higher than that of gene transfer DC alone (P<0.001).Compared with previous immunization, the levels of specific IgG increased significantly in sera from group of S. japonicum encoding gene-transferred DC 2 weeks after the last immunization (P<0.05), the levels of IFN-γ increased significantly (P<0.01), while the levels of IL-4 were not significantly different. In response to ConA and SEA, the level of IFN-γ in the culture supernatant of spleen lymphocytes from group of S. japonicum encoding gene-transferred DC increased significantly, the level of IL-4 decreased significantly, while SI increased significantly (compared with control group, P<0.001). Results indicated that S. japonicum encoding gene transfer can promote DC maturation and enhance the biologic activity of DC. DC multivalent nucleic acid vaccine could induce and enhance protective immunity against infection of S. japonicum. Predominant Th1 type immune response might play an important role in the protective immunity induced by gene-transferred DC against infection of S. japonicum.

Keywords：Schistosoma japonicum; dendritic cell; multivalent nucleic acid vaccine; protective immunity

湖北省自然科學基金項目(No.2012FFC01501)，湖北省衛生廳科研項目(No.XF2012-13)和湖北省大學生創新創業訓練計劃項目(No.201310927009)聯合資助