貴州省安順地區蛇源裂頭蚴分離株的分子鑒定及種系發育關系分析

李金福，劉艷丹，陳　艷，裘學麗

?

貴州省安順地區蛇源裂頭蚴分離株的分子鑒定及種系發育關系分析

李金福，劉艷丹，陳艷，裘學麗

貴州醫科大學人體寄生蟲學教研室,貴陽550004

摘要：目的對貴州省安順地區蛇源裂頭蚴分離株進行分子鑒定及種系發育關系的分析。方法采集貴州安順地區4種常見野生蛇(王錦蛇、烏梢蛇、黑眉錦蛇、灰鼠蛇)來源的裂頭蚴，分別提取各裂頭蚴基因組DNA，PCR擴增ITS1和cox1基因，所得PCR擴增產物經純化并T-A克隆后測序。運用ClustalX1.81生物分析軟件，將所得序列與GenBank所錄迭宮屬絳蟲和其它屬絳蟲基因序列進行多重序列比對分析，并應用軟件MEGA 6.0構建系統發育樹(鄰位連接法)。結果成功擴增出8株裂頭蚴的ITS1和cox1基因序列，ITS1大小為822～863 bp，cox1大小為404～415 bp，與預期的基因片段大小一致。基于ITS1和cox1基因序列構建的種系發育樹與所有的猬迭宮絳蟲均構成同一亞群，總分支的自展值高于50%，二者在不同的分離株之間呈現基因多態性。對8株裂頭蚴ITS1和cox1序列的同源性進行比較，ITS1的同源性為70.27%～82.84%，而cox1的同源性為95.63%～99.50%，顯示cox1的同源性高于ITS1。已向GenBank提交ITS1和cox1新序列各一條，登錄號分別為KF990161和KJ418421。結論貴州安順地區不同蛇源裂頭蚴分離株之間存在基因多態性。從總分支的自展值來看，cox1比ITS1更適合用于種內遺傳多態性研究，ITS1適合做定種的分子標記。

關鍵詞：裂頭蚴；第一內轉錄間隔區；細胞色素C氧化酶第一基因；種系發育分析

Supported by the Science and Technology Department of Guizhou Province (No. 2014-3024)

迄今，有關迭宮屬絳蟲種類的報告，全世界共計40余種之多，但多為從形態學、生物學及生物化學等方面鑒定的種類，因此，同物異名現象普遍[1]。猬迭宮絳蟲是許多國家，包括我國的流行蟲種，其同物異名也多達數十種。猬迭宮絳蟲的中間宿主和終宿主種類較多，在不同的地理環境和宿主體內，蟲體會出現基因遺傳差異。開展貴州不同蛇源裂頭蚴蟲株的分子鑒定，分析不同蛇源裂頭蚴分離株ITS1和cox1基因序列，比較其同源性，其目的是確定貴州省致病蟲株的基因型，揭示貴州不同蛇源裂頭蚴之間的種內關系，為進一步研究不同基因型蛇源裂頭蚴的生物學特性、致病性差異以及藥物敏感性等奠定基礎[2-3]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲株來源從野生王錦蛇(Elaphecarinata)、烏梢蛇(Zaocysdhumnades)、黑眉錦蛇(Elaphetaeniura)及灰鼠蛇(Ptyaskorro)(捕獲于貴州安順地區)皮下檢獲裂頭蚴后，先用生理鹽水清洗蟲體，然后對蟲體進行形態鑒定，蟲體保存于70%酒精溶液中。蟲株編號：王錦蛇株1-2號(WJ1-2)、烏梢蛇株1-2號(WS1-2)、黑眉錦蛇株1-2(HM1-2)及灰鼠蛇株1-2(HS1-2)。

1.1.2主要試劑Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒、T-A克隆試劑盒購于大連寶生物公司；分子量標準DNA marker DL2000、2×Es Taq MasterMix(含染料)、 DNA凝膠回收試劑盒為北京康為生物有限公司產品；其它試劑為進口或國產分析純。

1.1.3引物序列參考Jeon等[4]的文獻設計擴增ITS1及cox1基因的兩對引物。PL-cox1F：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′、PL-cox1R：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′；PL-ITS1F：5′-AACAAGGTTTCCGTAGGTG-3′、PL-ITS1R：5′-AGCAGTCTGCGATTCACATT-3′。引物由北京鼎國生物股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1裂頭蚴基因組DNA提取按Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒使用說明書提取裂頭蚴基因組DNA，所獲基因組DNA置于-20 ℃保存備用。

1.2.2PCR擴增ITS1序列和cox1基因的體系及條件50 μL反應體系：2×Es Taq MasterMix (含有EsTaqDNA Polymerase、2×Es Taq PCR Buffer，3 mmol MgCl2和400 μmol dNTP mix)25 μL、10 μmol/L 引物各2 μL、DNA 模板1 μL(<1 μg)和RNase-Free Water 20 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃延伸2 min。

1.2.3PCR擴增基因片段測序PCR產物經膠回收純化后做T-A克隆測序。序列測定交由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行。

1.2.4序列數據分析測序所得序列先與NCBI數據庫收錄基因序列進行BLAST比對，鑒定所獲蟲株為何種裂頭蚴，之后再與GenBank收錄的所有迭宮屬絳蟲和其它屬絳蟲的ITS1基因序列和cox1基因序列進行種間和種內比對；用ClustalX 1.81進行序列同源性比較和完全比對。利用MEGA6.0軟件對貴州安順地區8株蛇源裂頭蚴標本之間進行序列遺傳多樣性分析。

1.2.5分子系統發育樹構建利用MEGA6.0軟件構建系統發育樹。采用貴州安順地區分離的8株蛇源裂頭蚴標本的cox1基因和ITS1序列，用GenBank已錄其他屬絳蟲cox1基因和ITS1序列作外類群，以NJ法構建種間系統發育樹；用GenBank已錄猬迭宮絳蟲cox1基因和ITS1序列作外類群，以NJ法構建種內系統發育樹；以NJ法構建8株蛇源裂頭蚴標本的株間系統發育樹。種間、種內及株間的系統發育樹自展值(Boot-strap values)重復1 000次，取多數的一致樹。

2結果

2.1PCR擴增結果對貴州安順地區8個裂頭蚴標本的cox1和ITS1基因序列進行擴增，cox1大小約400 bp左右，與預期的cox1基因片段大小一致(圖1)。ITS1大小約800 bp左右，與預期的ITS1基因片段大小一致(圖2)，8個標本cox1和ITS1基因擴增片段的大小及GC含量見表1。

2.2新序列提交用BankIt向NCBI提交了兩個序列，cox1提交的是WS1標本，ITS1提交的是HM1標本，GenBank登陸號分別為KF990161和KJ418421。

2.3裂頭蚴株之間同源性比較對貴州安順地區8株蛇源裂頭蚴的cox1基因和ITS1序列的同源性進行比較，結果顯示cox1基因的同源性為95.63%～99.50%，而ITS1序列的同源性為70.27%～82.84%。

2.4安順地區裂頭蚴株與已知各屬絳蟲cox1基因和ITS1序列同源性比較用WS1標本的cox1基因、HM1標本的ITS1序列與GenBank已錄各屬絳蟲cox1和ITS1序列做比較，發現貴州安順地區裂頭蚴株的cox1基因和ITS1序列與已錄猬迭宮絳蟲序列具有很高的同源性，與其它各屬絳蟲序列具有較低的同源性(表2)。

M：DL 2 000相對分子質量標準；WS1-2：為烏梢蛇1-2的cox1擴增片段；WJ1-2：為王錦蛇1-2的cox1擴增片段；HM1-2：為黑眉錦蛇1-2的cox1擴增片段；HS1-2：為灰鼠蛇1-2的cox1擴增片段；DZ：陰性對照。M: DL 2000 DNA Marker; WS1-2: PCR products of cox1 of samples 1-2 from Zaocys dhumnades; WJ1-2:PCR products of cox1 of samples 1-2 from Elaphe carinata; HM1-2: PCR products of cox1 of samples 1-2 from Elaphe taeniura; HS1-2: PCR products of cox1 of samples 1-2 from Ptyas korros; DZ: Negative control.圖1　8株裂頭蚴cox1基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1　Analysis of PCR amplified cox1 genes from 8 pleroceroid strains by agarose gel electrophoresis

M：DL 2 000相對分子質量標準；WS1-2：為烏梢蛇1-2的ITS1擴增片段；WJ1-2：為王錦蛇1-2的ITS1擴增片段；HM1-2：為黑眉錦蛇1-2的ITS1擴增片段；HS1-2：為灰鼠蛇1-2的ITS1擴增片段；DZ：陰性對照。M: DL 2000 DNA Marker; WS1-2: PCR products of ITS1 of samples 1-2 from Zaocys dhumnades; WJ1-2: PCR products of ITS1 of samples 1-2 from Elaphe carinata; HM1-2: PCR products of ITS1 of samples 1-2 from Elaphe taeniura; HS1-2: PCR products of ITS1 of samples 1-2 from Ptyas korros; DZ: Negative control.圖2　8株裂頭蚴ITS1基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.2　Analysis of PCR amplified ITS1 genes from 8 pleroceroid strains by agarose gel electrophoresis

表18株裂頭蚴cox1及ITS1基因的長度及GC含量

Tab.1Guanine-cytosine (GC) content and length of the cox1 and ITS1 sequences of 8 pleroceroid strains

裂頭蚴株cox1長度/bpGC含量(%)ITS1長度/bpGC含量(%)pleroceroidstrainscox1length/bpGCcontent(%)ITS1length/bpGCcontent(%)WS140472.583953.1WS241472.083652.1WJ141571.886348.6WJ241471.584935.2HM141272.885137.1HM241572.785936.9HS141472.582234.4HS241572.082334.9

表2裂頭蚴與其他不同絳蟲的cox1和ITS1序列同源性比對

Tab.2Homology comparison of cox1 and ITS1 sequences between plerocercoids and other different tapeworms

種類Species基因GeneNCBI登錄號NCBIAccessionID同源性(%)Homology(%)猬迭宮絳蟲cox1GQ99994799.12SpirometraerinaceieurITS1FJ88674777.34肥胖帶絳蟲cox1U4598848.11TaeniasaginataITS1AY39204524.86闊節裂頭絳蟲cox1AB26932582.18DiphyllobothriumITS1KF21824628.59

表2(續)

種類Species基因GeneNCBI登錄號NCBIAccessionID同源性(%)Homology(%)細粒棘球絳蟲cox1JQ35671975.06EchinococcusgranulosusITS1AH00900827.50縮小膜殼絳蟲cox1KF68968769.92HymenolepidiminutaITS1KC99041027.80犬復孔絳蟲cox1None―DipylidiumcaninumITS1AM49133930.59

2.58株裂頭蚴差異分析根據同源性比對的結果，選取cox1基因，利用MEG6.0軟件對貴州安順地區8株蛇源裂頭蚴標本之間進行序列多樣性分析。根據完全比對結果，校對并除去cox1兩端的不穩定序列，最終獲得了397 bp的cox1基因片段，沒有發現堿基的插人和缺失。對8個標本DNA序列進行遺傳多樣性分析，8個標本共有12個變異位點，其中有7個為簡約信息位點。12個變異位點中，轉換數為11個(3個為C/T轉換，8個為A/G轉換)，僅有2個A/T顛換，轉換/顛換率為5.5，轉換明顯多于顛換，表明8株蛇源裂頭蚴標本的cox1基因序列變異還未達到飽和狀態，可以將此基因應用于遺傳變異和系統進化分析(表3)。

基于cox1基因，用MEGA6.0軟件根據Kimura雙參數模型計算了8株標本間的遺傳距離。結果

表明，標本間的遺傳距離差異不大，范圍為0.005 07～0．003 120，平均遺傳距離為0.018 28(表4)。

表38株裂頭蚴cox1基因變異位點

Tab.3Mutation sites of cox1 sequences of 8 pleroceroid strains

裂頭蚴株cox1序列pleroceroidstrainscox1sequence5'-3'WS1CGGAACGCTCATWS2CGGAACGCTCATWJ1CGG.ACGCTCGTWJ2CGCTACGCTCGTHM1CGGT.CGCTCGTHM2G..TACGCTCATHS1CGGCATATCTACHS2CGGAATATCTAC

表48株裂頭蚴cox1基因片段間的遺傳距離

Tab.4Genetic distance of cox1 gene fragments of 8 pleroceroid strains

裂頭蚴株pleroceroidstrainsWS1HS2WS2HM1HM2WJ1WJ2HS1WS1HS20.00507WS20.007640.01018HM10.015360.010180.01536HM20.015330.015360.015400.00507WJ10.010180.010200.015400.015400.01020WJ20.028460.031040.025700.031120.031200.03120HS10.017840.023090.025760.028410.028340.023090.01023

2.6應用NJ法構建系統發育樹

2.6.1種間系統發育樹構建采用WS1標本的cox1(KJ418421)基因和HM1標本的ITS1(KF990161)序列，用GenBank已錄的其他屬絳蟲cox1基因(E.granulosusJQ356719，H.diminutaKF689687，D.latumAB269325，T.saginata U45988)和ITS1序列(D.caninumAM491339，E.granulosusAH009008，D.latumKF218246，T.saginataAY392045，H.diminutaKC990410)作外類群，以NJ法構建種間系統發育樹。基于ITS1序列構建的多數種系發育樹(圖3)中，顯示本次檢測的裂頭蚴株(HM1)與已知的其他屬絳蟲處于不同分支。亞群內出現3個主要拓撲分支，自展值高于40%。基于cox1基因構建的多數的種系發育樹(圖4)中，顯示本次檢測的裂頭蚴(WS1)與所知的其他屬絳蟲處于不同分支，亞群內出現3個主要拓撲分支，自展值高于80%。

圖3　基于ITS1基因序列以鄰位置連接法構建的多數一致樹(種間)Fig.3　Bootstrap cut-off consensus tree inferred from ITS1 gene given in text using the Neighbor-Joining method

圖4　基于cox1基因序列以鄰位置連接法構建的多數一致樹(種間)Fig.4　Bootstrap cut-off consensus tree inferred from cox1 gene given in text using the Neighbor-Joining method

2.6.2種內系統發育樹構建采用WS1標本的cox1基因(KJ418421)和HM1標本的ITS1(KF990161)序列，用GenBank已錄的猬迭宮絳蟲cox1基因(S.erinaceieuropaeiAB278577，S.erinaceieuropaeiAB278576，S.erinaceieuropaeiAB278575，S.erinaceieuropaeiAB278574，S.erinaceieuropaeiAB278573，SpirometraGQ999947，)和ITS1序列(S.erinaceieuropaeiFJ886755，S.erinaceieuropaeiFJ886752，S.erinaceieuropaeiFJ886751，S.erinaceieuropaeiFJ886754，S.erinaceieuropaeiFJ886753，S.erinaceieuropaeiFJ886747)作外類群，以NJ法構建種內系統發育樹。基于ITS1序列構建的60%種系發育樹(圖5)中，顯示本次檢測的裂頭蚴株(HM1)與已知的猬迭宮絳蟲均處于同一個亞群內。亞群內出現3個主要拓撲分支，自展值分別為72%，100%，和100%，HM1和FJ886747為一分支。基于cox1基因構建的60%的種系發育樹(圖6)中，顯示本次檢測的裂頭蚴(WS1)與所知的猬迭宮絳蟲形成同一個亞群，亞群內出現3個主要拓撲分支，自展值分別為57%，82%，和89%。WS1與GQ999947處于同一分支的亞支，自展值為100%。

圖5　基于ITS1序列以鄰位置連接法構建的60%多數一致樹(種內) Fig.5　Bootstrap 60% cut-off consensus tree inferred from ITS1 gene given in text using the Neighbor-Joining method

圖6　基于cox1基因以鄰位置連接法構建的60%多數一致樹(種內)Fig.6　Bootstrap 60% cut-off consensus tree inferred from cox1 gene given in text using the Neighbor-Joining method

2.6.3株間系統發育樹構建采用8株裂頭蚴標本的cox1基因和ITS1序列以NJ法構建株間系統發育樹。基于TIS1序列構建的60%株間發育樹(圖7)中，總共分有2個大分支，HS1和HS2為1分支的亞支，WS1和WS2為2分支的亞支，HM1和HM2是1分支的亞支，而WJ1和WJ2分屬于2個分支，兩大分支的自展值檢測分別為68%和100%。基于cox1基因構建的60%的株間發育樹(圖8)中，總共分有3個大分支，WS1和HS2為1分支，WS2為2分支，WJ1，HM2和HM1號為3分支的亞支，HS1和WJ2為3分支的另一亞支。3大分支的自展值檢測分別為81%和100%和68%。

圖7　用裂頭蚴ITS1序列構建的系統發育樹(鄰位連接法)Fig.7　Phylogenetic construction based on plerocercoid ITS1 sequences(Neighbor Joining Method)

圖8　用裂頭蚴cox1基因構建的系統發育樹(鄰位連接法)Fig.8　Phylogenetic construction based on plerocercoid cox1 sequences(Neighbor Joining Method)

3討論

在蟲株的分子鑒定及種系發育關系的分析中，分子標記的選擇十分重要，如果分子標記的變異太小，種群的差異不易發現，而變異太大，則可造成趨同進化的假象，混淆真正的親緣關系[5]。ITS基因序列存在于核糖體DNA(rDNA)中，它的進化速度慢而且長度較小，相對保守，因而常被運用于分子發育種間及種內研究。cox基因位于線粒體DNA(MtDNA)中，線粒體基因組具有結構簡單、母系遺傳、缺少重組、進化速率快等特點，特別適合作為遺傳學研究的標記，已被許多學者用來研究多種寄生蟲的種間和種內遺傳變異。因此，本文采用了這2個分子標記進行研究。

本研究測定了貴州安順地區4種蛇源8個裂頭蚴蟲株的ITS1和cox1基因。ITS1大小為822～863 bp，各標本ITS1長度差異較大，而cox1大小為404～415 bp，各標本的差異較小。對8株裂頭蚴ITS1和cox1序列的同源性進行比較，ITS1的同源性為70.27%～82.84%，而cox1的同源性為95.63%～99.50%，顯示cox1的同源性高于ITS1。

取HM1標本的ITS1序列和WS1標本的cox1基因在GenBank里在線BLAST，發現ITS1有序列同源性達到77%，基因登錄號是FJ886747，為Spirometraerinaceieuropaei的ITS1序列；發現cox1有序列同源性達到99%，基因登陸號是GQ999947，為Spirometraerinaceieuropaei的cox1基因。在種內系統發育樹中，HM1標本的ITS1序列和FJ886747為同一分支，自展值100%，WS1標本的cox1基因和GQ999947為同一分支，自展值100%。通過ITS1及cox1兩個基因的BLAST比對，種內系統發育樹中的親緣關系，可鑒定所得標本HM1及WS1均為猬迭宮絳蟲。

另外，用HS1標本的cox1基因、WS1標本的ITS1序列和其他各屬絳蟲cox1和ITS1序列作序列對比，發現種內cox1基因序列差異(0.74%～4.37%)明顯低于種間差異(17.82%～51.89%)；種內ITS1序列差異(19.29%～29.73%)也明顯低于種間差異(69.41%～75.14%)，表明迭宮絳蟲cox1和ITS1序列種內相對保守，種間差異較大，故均可作為種間遺傳變異研究的分子標記，可用于迭宮絳蟲的鑒定。

本研究運用NJ法，基于ITS1序列和cox1基因，分別構建了種間、種內系統發育樹，以及8個蛇源裂頭蚴標本之間的株間系統發育樹，其中 Bootstrap method檢測自展值1 000次，結果取多數發育樹，大部分高于60，說明發育樹比較可靠。

根據3種系統發育樹，觀察到基于cox1的發育樹敏感度要比ITS1要高，樹的進化距離值也比ITS1序列要低很多，由此可推斷，在猬迭宮絳蟲裂頭蚴分子種系發育關系研究中，運用ITS基因序列有可能更適合于做定種的分子標記，而cox1更適合于做種內遺傳多態性研究。

Zhu XQ等[6]基于cox1基因進行多態性分析的情況，他們發現在澳大利亞從不同宿主分離得到的S.erinaceieuropaei至少存在2種基因型。而Okamoto M[7]等的研究也同樣支持了這個結論，他從不同國家分離得到的S.erinaceieuropaei，種內也存在不同基因型。本研究根據8個蛇源裂頭蚴之間系統發育樹的結果來看，同樣支持這個結論，且進一步分析推測，不同蛇源裂頭蚴基因型有差異，同種S.erinaceieuropaei，種內可能存在不同基因型。基于ITS1序列的系統發育樹，8個裂頭蚴標本可分3個基因型。基于cox1基因的系統發育樹，8個裂頭蚴標本可分2個基因型。

除了ITS序列與cox1基因可作為猬迭宮絳蟲很好的分類鑒定的分子標記之外，線粒體nad基因也是絳蟲分類鑒定理想的遺傳標記之一。劉自逵等[8-9]的研究表明，猬迭宮絳蟲nadl比cox1基因序列的種間與種內差異要大一些。伍慧蘭等[10]在對猬裂頭蚴nad4基因的分析中也發現日本株和湖南株的pnad4的序列存在一定的差異。今后在裂頭蚴種群關系的研究中，可以結合這幾種基因，為蟲株作精確的鑒定和分類，為有效診斷和控制裂頭蚴病奠定基礎。

參考文獻：

[1] Chen Y. Harm, prevention and cure of food-borne parasitic disease[M]. Guiyang: Guizhou science press, 2013: 15-50. (in Chinese)

陳艷.食源性裂頭絳蟲病的危害與防治[M].貴陽：貴州科技出版社，2013：15-50.

[2] Li WW, Li J, Li SQ, et al. Molecular identification and phylogenetic analysis of plerocercoids in snakes from Guilin city[J]. Prog Vet Med, 2011, 32(10): 28-30. (in Chinese)

李雯雯，李健，李樹清，等. 桂林蛇源裂頭蚴分離株的分子鑒定及種系發育關系分析[J]. 動物醫學進展，2011，32(10)：28-30.

[3] Wang ZR, Bao HE. Identification ofTaeniasaginataby mtCOI in four areas of Yunnan and Guizhou province[J].Chin J Parasitol Parasit Dis, 2003, 21(1): 20-23. (in Chinese)

王正蓉, 包懷恩. 用mtCOI技術測定云南及貴州四地區的牛帶絳蟲[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志, 2003, 21(1): 20-23.

[4] Jeon HK, Kim KH, Huh S, et al. Morphologic and genetic identification ofDiphyllobothriumnihonkaiensein Korea[J]. Korean J Parasitol, 2009, 47(4): 369-375. DOI: 10.3347/kjp.2009.47.4.369

[5] Li WP, Cui JY. Sequence and phylogenetic analysis of mitochondrialcox1 gene ofSpirometraerinaceieuropaei[J]. Chin

Livestock Poultry Breeding, 2012, 8(8): 60-61. (in Chinese)

李偉平，崔建楊.猬迭宮絳蟲的線粒體cox1序列測定及種系發育關系分析[J].中國畜禽種業，2012，8(8)：60-61.

[6] Zhu XQ, Beveridge I, Berger L, et al. Single-strand conformation polymorphism-based analysis reveals genetic variation withinSpirometraerinacei(Cestoda:Pseudophyllidea) from Australia[J]. Mol Cellular Probes, 2002, 16: 159-165. DOI: 10.1006/mcpr.2002.0406

[7] Okamoto M, Iseto C, Shibahara T, et al. Intraspecific variation ofSpirometraerinaceieuropaeiand phylogenetic relationship betweenSpirometraandDiphyllobothriuminferred from mitochondrial COI gene sequences[J]. Parasitol Int, 2007, 56: 235-238. DOI: 10.1016/j.parint.2007.03.003

[8] Liu ZK, Liu GH, Dai RS, et al. Sequence and phylogenetic analysis of mitochondrialcox1 andnad1 genes forSpirometraerinaceieuropaeiisolates from Hunan province[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2010, 41(4): 463-468. (in Chinese)

劉自逵，劉國華，戴榮四，等. 湖南省猬迭宮絳蟲的線粒體cox1和nad1基因的序列測定及種系發育分析[J]. 畜牧獸醫學報，2010，41(4)：463-468.

[9] Liu DW, Zhu B, Wang XB, et al. Molecular cloning of two fragments cDNA containing repeat units inSpirometraerinaceieuropaei[J]. Chin J Dis Ctrl Prev, 2001, 5(4): 294-297. (in Chinese)

劉殿武，朱冰，王曉波，等. 猬迭宮絳蟲幼蟲含重復序列的cDNA 的分子克隆[J]. 疾病控制雜志，2001，5(4)：294-297.

[10]Wu HL. Cloning and sequence analysis of mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 4 ofSparganumerinaceieuropaeiisolates from Hunan Province[J]. Prog Vet Med, 2010, 31(12): 61-63. (in Chinese)

伍慧蘭. 猬裂頭蚴線粒體nad4基因的克隆及序列分析[J]. 動物醫學進展，2010，31(12)：61-63.

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.012

通訊作者：陳艷，Email:chenyan757@sina.com

中圖分類號：R383

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0376-07

Corresponding author:Chen Yan, Email: chenyan757@sina.com

收稿日期：2015-09-24修回日期：2016-01-08

Molecular identification and phylogenetic analysis of plerocercoids in snakes from Anshun, Guizhou, China

LI Jin-fu, LIU Yan-dan, CHEN Yan, QIU Xue-li

(DepartmentofParasitology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Abstract:In this study, we investigated the taxonomy position of plerocercoids from snakes in Anshun area, Guizhou Province, China. Plerocercoids were isolated from the wild snakes (Elaphe carinata, Zaocys dhumnades, Elaphe taeniura, Ptyas korros) in this area. Internal transcribed spacer 1 (ITS1) gene and the mitochondrial cytochrome oxidase 1 (cox1) gene of the plerocercoids were amplified by PCR, and the sequences were measured. The similarity of sequences was aligned by ClustalX 1.81, and the phylogenetic trees were constructed by MEGA 6.0 (Neighbor-Joining method, NJ). Results showed that the ITS1 and cox1 sequences of 8 pleroceroid strains were amplified successfully by PCR, and the homology of sequences was aligned by ClustalX 1.81. The ITS1 was 822-863 bp, while cox1 was 404-415 bp. The homology of ITS1 and cox1 was 70.27%～82.84% and 95.63%～99.50%, respectively. The phylogenetic trees were constructed by MEGA 6.0(NJ). We had submitted an ITS1 and a cox1 new sequences to GenBank. The accession ID were KF990161 and KJ418421 respectively. The study results suggest that gene polymorphism between different isolates of pleroceroids from snakes in cox1 and ITS1, cox1 is more suitable than ITS1 in studying intra-specific genetic polymorphism which considered from the bootstrap values, and ITS1 could be used as genetic market for the species identification.

Keywords:pleroceroid; ITS1; cox1; phylogenetic analysis

貴州省科技廳社會發展攻關項目資助[No.(2014)3024號]