缺氧模型和多因素模型構建結核休眠菌模型比較研究

江莉莎，姚義勇，張　莉，柳　巖，郭述良

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缺氧模型和多因素模型構建結核休眠菌模型比較研究

江莉莎1，2，姚義勇1，張莉1，柳巖1，郭述良1

1.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸與危重癥醫學科，重慶400016；2.重慶醫科大學附屬第一醫院第一分院，重慶400016

摘要：目的比較缺氧模型及多因素模型兩種結核休眠菌建模方法的優劣。方法利用缺氧因素構建缺氧模型；利用低氧(5% O2)、高CO2(10% CO2)、弱酸(pH 5.0)及營養缺乏(10% 7H9液體培養基)多種因素構建多因素模型。分別在第20 d、30 d時取樣，用金胺O-尼羅紅染色法染色，在共聚焦顯微鏡下觀察結核菌脂質聚集及失去抗酸性的情況；用電鏡觀察結核菌細胞壁增厚情況；并檢測其對利福平的耐藥率。在建模30 d時，將等量的兩種模型分別轉入新鮮7H9液體培養基中，觀察并比較其復蘇情況。結果建模20 d時，兩模型組細菌均出現脂質聚集及失去抗酸性，無明顯差異。兩模型組細菌均未出現明顯細胞壁增厚。建模30 d時，多因素模型組細菌幾乎都表現出脂質聚集及失去抗酸性，而缺氧模型組仍有部分細菌未表現出脂質聚集及失去抗酸性。同時，多因素模型組在建模30 d還出現了細胞壁增厚的細菌，缺氧模型組則無明顯改變。多因素模型組細菌對利福平的耐藥率明顯高于缺氧模型組，且多因素模型組細菌復蘇的菌量遠小于缺氧模型組。結論多因素模型較缺氧模型能更快誘導結核菌進入休眠狀態，且誘導出的結核休眠菌狀態更穩定。

關鍵詞：結核休眠菌；缺氧模型；多因素模型；比較

The Major Science and Technology Program in the Nation “12th Five-year”Plan of China(No.2012ZX10003009) and the Nation Key Clinical Specialty Foundation(No.2012-649)

病程遷延，易復發，且多為內源性復發，是結核病難以攻克的難題，而結核休眠菌是其中的關鍵因素。結核菌是胞內寄生菌，機體免疫細胞吞噬結核菌后形成肉芽腫，將結核菌局限。結核菌在肉芽腫內處于缺氧、酸性以及營養缺乏等不利環境中，發生染色體復制幾乎停止，代謝降低，細胞壁增厚，變成球形，出現脂質聚集，失去抗酸染色特性等改變，進入休眠狀態。休眠的結核菌能逃避機體的免疫殺傷，并對結核經典化療藥物耐藥。結核休眠菌能長期潛伏，在機體免疫力下降時發展成為活動性結核病，所以結核休眠菌是結核病復發的根源。

但是目前對結核休眠菌建模方法的研究參差不齊，報道了多種結核休眠菌模型，卻各有優缺點。現已建立的結核休眠菌體外模型包括缺氧模型[1]、維生素C誘導模型[2]、饑餓模型[3]、多因素模型[4]、酸化模型[5]、結核肉芽腫模型[6]等。國內相關研究多采用缺氧模型作為休眠菌體外模型的建模方法，且一般不對建模成功與否做相關驗證。國外研究也尚無對各模型進行動態比較并作系統評價的報道,給建模方法的選擇帶來了困難。缺氧模型雖是研究最早，應用最廣泛的模型，但缺氧模型誘導結核菌進入休眠狀態的時間長，且為單一因素，不能完全模擬結核菌在結核肉芽腫內的生存狀態。研究表明結核菌在結核肉芽腫中處于一種微缺氧、弱酸及營養缺乏的狀態[4]，而多因素模型則能完全模擬這種狀態。本研究通過動態比較缺氧模型和多因素模型在細菌耐藥性、細胞壁增厚、脂質聚集及失去抗酸性、復蘇穩定性5個方面的特性對兩種模型進行系統評價，發現多因素模型能更快誘導結核菌進入休眠狀態，且通過其誘導的休眠菌狀態更穩定。

1材料與方法

1.1菌種結核分支桿菌標準株h17Rv(CMCC93004)購自重慶市胸科醫院，接種于中性羅氏培養基(珠海貝索)培養3～4周后，轉種于7H9液體培養基(BD，美國，含0.2%甘油、10% ADC及0.05% tween 80)，置于37 ℃ 160 r/min 搖床中震蕩培養12～15 d左右達對數生長期(OD600約為0.4～0.6)。

1.2結核休眠菌模型構建

1.2.1缺氧模型參照L G Wayne 和L G Hayes的方法[1]，略有改動，取對數生長期的結核菌，用研磨器研磨均勻，按1∶100的比例加入7H9液體培養基中，再加入終濃度1.5 μg/mL的亞甲藍，制成菌懸液，取10 mL菌懸液加入15 mL試管中(氣體與液體體積比1∶2)，用封口膠密閉試管口，置于37 ℃恒溫箱中靜止培養。培養7～10 d，亞甲藍顏色逐漸變淺，結核菌進入微缺氧狀態；12～15 d亞甲藍變為無色，進入完全缺氧狀態。

1.2.2多因素模型參照Chirajyoti Deb等的方法[4]，取對數生長期結核菌，5 000 r/min離心10 min去上清液，加入PBS 后5 000 r/min離心5 min，反復清洗2遍，將菌沉淀轉入酸化(pH 5.0)及營養缺乏的10% 7H9液體培養基中(含ADC但不含甘油及tween80，調節pH至5.0)，加入0.018% 泰洛沙泊，保持玻璃瓶內氣體與液體體積比為4∶1，用橡膠塞封閉瓶口，連接輸氣裝置，打開氣瓶減壓閥(量程0～0.25 Mpa)開關，調節輸出壓力至0.06 Mpa，將導管針頭插入橡膠塞，同時插入另一針頭作為出氣孔，向瓶內持續輸入低O2高CO2的混合氣體(5% O2+10% CO2+85% N2，購自成都宏景氣體公司)約3 min使瓶內空氣被混合氣體完全替代，隔天輸氣一次。

1.3金胺O-尼羅紅雙重染色參照Chirajyoti Deb等的方法[4]，于建模第20 d、30 d對兩種模型取樣，分別吸取缺氧模型及多因素模型菌液20 μL于載玻片上，加熱固定，滴加10 μg/mL金胺O染色液(珠海貝索)于載玻片上，在暗盒中染色15 min后，雙蒸水沖洗。再用3%鹽酸-酒精脫色3～5 min至看不見染色劑為止。再滴加2.5 μg/mL尼羅紅染色液染色10 min后，雙蒸水沖洗，用0.5%高錳酸鉀復染1 min，水洗，晾干，封片，在共聚焦顯微鏡下多視野觀察并拍照(紅色熒光在620 nm下激發，綠色熒光在599 nm下激發)，然后將紅色熒光和綠色熒光疊加組圖，以對數期菌為對照組。

1.4檢測對利福平的耐藥率參照文獻[1-4]中方法，在建模第20、30 d分別對兩種模型取樣，每種模型隨機分成兩組，實驗組加入利福平溶液(終濃度1 μg/mL)，對照組加入等量dd H2O，同時置于37 ℃恒溫箱中培養5 d。5 d后，每組取100 μL菌液，用7H9液體培養基10倍梯度稀釋到10-10，取各稀釋液100 μL接種于羅氏培養管上，置于37 ℃恒溫箱培養，連續觀察30 d，進行菌落計數，并計算耐藥率(耐藥率=實驗組細菌濃度/對照組細菌濃度×100%)。

1.5各組間差異性比較采用SPSS 19.0軟件(SPSS Inc.，USA)中兩獨立樣本t檢驗(P<0.05)模塊進行。

1.6電鏡在建模第20、30 d對兩種模型取樣，將缺氧模型和多因素模型菌液離心(4 000 r/min 10 min)，除去上清液，保留1.5 mL細菌液體。用槍頭吹打混勻，離心(10 000 r/min 15 min)，小心除去上清液，沿管壁加入3%戊二醛固定液1.5 mL再放入4 ℃保存。將標本送至重慶醫科大學生命科學院電鏡室行透射電鏡(Hitachi,H-7500 electron microscope)觀察及拍照。

1.7結核休眠菌復蘇實驗分別取缺氧模型和多因素模型建模30 d菌液，用7H9液體培養基將兩模型菌液調節至相同濃度(OD600約0.2)，再取等量相同濃度的兩模型菌液，以1∶100比例分別加入到2 mL新鮮的7H9液體培養基中，置于37 ℃搖床中培養12 d，觀察兩種模型復蘇的情況，每組設3個復管。

2結果

注：1.對數期菌；2.缺氧模型20 d；3.多因素模型20 d；4.缺氧模型30 d；5.多因素模型30 d。Note：1: exponential phase; 2: oxygen-deficit model 20th day; 3: multiple-stress model 20th day; 4: oxygen-deficit model 30th day; 5: multiple-stress model 30th day.圖1　結核休眠菌脂質聚集及失去抗酸性Fig.1　Acid-fastness of Mtb cells and lipid body accumulation within the Mtb cells

*P<0.05圖2　各模型組不同時間點對利福平的耐藥率Fig.2　Drug resistance rate to rifampicin at different time

2.1脂質聚集及失去抗酸性運用金胺O-尼羅紅雙重染色法，檢測結核菌休眠菌脂質聚集及失去抗酸性兩種特性[4,6]。金胺O使抗酸菌染色發綠光，尼羅紅使脂質染色發紅光。如圖1所示，與對數期菌相比，缺氧模型和多因素模型在建模20 d時，均出現紅色熒光比例增高，綠色熒光比例減低，表明2種模型均出現脂質聚集和失去抗酸性，模型構建成功，但未表現出明顯差異。隨著建模時間延長，在兩種建模第30 d時，發現多因素模型在多個視野中幾乎全是紅色熒光，沒有綠色熒光，這表明多因素模型能在較短時間內使更高比例的結核分支桿菌出現脂質聚集、失去抗酸性，進入休眠狀態。構建的休眠菌模型中，存在3種結核菌亞群：發紅色的細菌，為完全失去抗酸性，有脂質聚集的細菌，則其完全休眠；發綠色熒光的細菌，為存在抗酸性，無脂質聚集的細菌，則其處于活躍期；發黃色熒光的細菌，為部分失去抗酸性和部分脂質聚集的細菌，為紅色熒光和綠色熒光的混合色，則其處于半休眠狀態。

2.2檢測對利福平的耐藥率如圖2所示，在建模第20 d時，多因素模型對利福平的耐藥率明顯高于缺氧模型，表明多因素模型能誘導結核菌進入更深的休眠狀態。但出人意料的是，缺氧模型和多因素模型，建模20 d時對利福平的耐藥率均高于建模30 d的結果。

2.3電鏡電鏡觀察發現，在建模20 d時，缺氧模型及多因素模型均未出現明顯的結核菌細胞壁增厚。而建模30 d時，缺氧模型中仍未出現細胞壁增厚的結核菌，而多因素模型中卻出現了部分細胞壁增厚、交聯增加(透光度減低)的結核菌。(圖3)

注：1.缺氧模型20 d；2.多因素模型20 d；3.缺氧模型30 d；4.多因素模型30 d。Note：1: oxygen-deficit model 20th day; 2: multiple-stress model 20th day; 3: oxygen-deficit model 30th day; 4: multiple-stress model 30th day.圖3　結核休眠菌細胞壁增厚情況Fig.3　Cell wall thickness of dormant M.tb cells

2.4結核休眠菌復蘇實驗培養第4 d時，缺氧模型及多因素模型管底開始有少量細菌出現，隨后逐漸增多。培養第10 d時，多因素模型組管底菌量明顯少于缺氧模型組(圖4)。隨著培養時間延長，2組管底細菌逐漸變黃，細菌量稍有增多。

注：A：多因素模型組； B：缺氧模型組。Note：A: Multiple-stress model; B: Oxygen-deficit model.圖4　結核休眠菌復蘇實驗Fig.4　Auto-resuscitation for dormant M.tb

3討論

世界上有1/3的人口都有潛伏結核感染，潛伏結核感染患者常不表現出臨床癥狀[7]。患者體內的結核菌處于一種休眠狀態，但當機體免疫力下降時，休眠的結核菌則會重新復蘇，使結核病復發，久治不愈。因此，對結核休眠菌的研究十分必要。

已有研究表明，結核菌進入休眠狀態時需要通過脂質聚集的方式儲存能量，使其在休眠過程中存活，因此脂質聚集是結核休眠菌一項重要特性[4]。在結核肉芽腫休眠模型、泡沫巨噬細胞休眠模型、缺氧模型、多因素模型中，結核休眠菌均表現出失去抗酸性和脂質聚集[1,4,6]。另外，多篇文獻報道脂質聚集主要指三酰甘油(TG)的聚集[8-9]，三酰甘油聚集受tgs-1基因調控，而結核菌在缺氧、NO及多因素模型中均出現tgs-1上調，進一步說明了脂質聚集是結核休眠菌的重要特性。本實驗發現在建模30 d時，多因素模型組較缺氧模型組脂質聚集及失去抗酸性均更明顯，表明多因素模型能更快的誘導休眠狀態。

對經典化療藥物(如異煙肼、利福平)表型耐藥是結核休眠菌的特點，正因為如此才使結核病反復發作、遷延不愈，而表型耐藥的出現，是由于細菌的生理狀態改變引起的，與基因型耐藥無任何相關性[10]。抗生素的活性發揮依賴于細菌的生長狀態，這一現象已被Kondo 及Kanai利用老鼠動物模型證實：在缺乏鏈霉素，鏈霉素依賴型結核菌不生長時，結核藥物治療無效；而存在鏈霉素，鏈霉素依賴型結核菌可生長時，結核藥物治療則有效[10]。因此，休眠菌出現表型耐藥，是由于結核菌停止生長引起。化療藥物中，異煙肼主要作用于活躍期結核菌，而利福平對靜止期結核菌也有一定的殺滅作用。若結核菌對利福平表型耐藥，則細菌進入了更深的休眠狀態[4]。本實驗中多因素模型對利福平的耐藥率明顯高于缺氧模型，表明多因素模型能誘導結核菌進入更深的休眠狀態。實驗中意外發現無論是缺氧模型和多因素模型在建模30 d時細菌耐藥率均低于建模20 d時，這與休眠狀態越深，則耐藥率越高的普遍規律相違背。究其原因，發現結核菌進入極深的休眠時，會出現不可培養狀態[11]。由實驗方法可知，細菌耐藥率的計算與羅氏培養細菌計數結果相關，推測可能為建模30 d時細菌耐藥率低于建模20 d的原因。

除生化特性改變外，結核休眠菌在形態學上也有明顯的改變。結核菌在缺氧或微缺氧狀態下進入不復制狀態后，會出現細胞壁增厚[12]。在酸化模型中，建模45 d還可觀察到結核菌變為卵圓形[5]。因此，細胞壁增厚、變成球形是結核休眠菌的另一重要特性。通過多因素模型與缺氧模型細菌電鏡觀察，同樣觀察到兩模型在建模30 d時表現出明顯差異。多因素模型組出現了部分細胞壁增厚，透光度明顯降低的結核菌，細菌進入休眠狀態，而缺氧模型組尚未出現。誘導休眠所需時間較長，一直是缺氧模型建模困難的原因，缺氧模型中，結核菌出現明顯的細胞壁增厚需要120 d[13]。而多因素模型能在30 d內誘導出細胞壁增厚的結核菌，使其快速進入休眠狀態，為休眠菌模型構建解決了一大難題。

結核菌能在各種不利因素如缺氧、饑餓、弱酸等體外條件誘導下，進入休眠狀態。但是當撤銷這些不利因素，使結核休眠菌進入新鮮的液體培養基培養后，結核休眠菌又會復蘇，這對保持休眠狀態的穩定性是不利的[1,4]。兩種模型的復蘇實驗表明，多因素模型組細菌復蘇的菌量遠小于缺氧模型組，則多因素模型產生的結核休眠菌狀態更穩定。

根據上述實驗，多因素模型不管從誘導休眠菌的時間，還是結核休眠菌狀態的穩定性，均優于缺氧模型。本研究在系統評價兩種模型的同時，對兩種模型進行了比較，為其他研究者選擇休眠菌模型構建方法提供了參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.003

通訊作者：郭述良，Email：guosl999@sina.com

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)04-0327-05

Corresponding author:Guo Shu-liang,Email:guosl999@sina.com

收稿日期：2015-08-06修回日期：2015-12-13

Comparative study of twoinvitrodormant models forMycobacteriumtuberculosis

JIANG Li-sha1,2，YAO Yi-yong1，ZHANG Li1，LIU Yan1，GUO Shu-liang1

(1.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine，theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China;2.ThefirstbranchtheFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China)

Abstract:To compare the oxygen-deficit model with the multiple-stress model，and understand their pros and cons，the oxygen-deficit model was constructed by applying gradually low oxygen. The multiple-stress model was developed by applying combined stress of low oxygen (5% O2)，high carbon dioxide (10% CO2)，faintly acid (pH 5.0) and lack of nutrient (10% 7H9 broth). After both the models were constructed for 20 days and 30 days，respectively，the sample was collected. Loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies was observed through confocal microscopy after dual staining of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) with the combination Auramine-O and Nile Red. Cell wall thickness of Mtb was observed by electron microscope. And the drug-resistance rate to rifampicin (Rif) was also detected. At 30th day，equivalent Mtb of two models was subcultured into fresh 7H9 broth to observe the auto-resuscitation. We discovered that Mtb of two models showed loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies but no transformation of cell wall at 20th day. Mtb of multiple-stress model almost showed loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies at 30th day. However，portions of Mtb did not show loss of acid fastness and accumulation of lipid bodies in oxygen-deficit model. At 30th day，cell wall thickness of Mtb was observed in multiple-stress model but did not in oxygen-deficit model. The drug-resistance rate to rifampicin of multiple-stress model was obviously higher than that of oxygen-deficit model，and the amount of Mtb in multiple-stress model was smaller than that of oxygen-deficit model after auto-resuscitation in fresh 7H9 broth. In Conclusion，Mtb could develope dormant state more rapid in multiple-stress model，and its dormant state was more stable.

Keywords:dormant Mycobacterium tuberculosis; oxygen-deficit model; multiple-stress model; comparison

國家“十二五”重大專項課題(No.2012ZX10003009),國家臨床重點專科專項經費(No.2012-649) 聯合資助