金納米棒免疫傳感器檢測不同感染周期日本血吸蟲循環抗原的研究

何　鑫，汪世平，周云飛，黃成銘，閭丘思嘉，寧水兵

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金納米棒免疫傳感器檢測不同感染周期日本血吸蟲循環抗原的研究

何鑫，汪世平，周云飛，黃成銘，閭丘思嘉，寧水兵

中南大學基礎醫學院寄生蟲學系，長沙410078

摘要:目的利用金硫共價鍵成功構建固相金納米棒免疫傳感器，檢測不同感染周期的日本血吸蟲循環抗原，并分析宿主體內抗體的消長變化。方法晶種生長法制備金納米棒溶液，與表面帶有巰基基團的ITO玻片以金硫共價鍵組裝成固相金納米棒免疫傳感器。聚4-苯乙烯磺酸鈉(PSS)和聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)修飾固相金納米棒免疫傳感器表面，并結合日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原26-28 kDa單鏈抗體(SIEA26-28kDaSjscFv)，檢測日本血吸蟲不同感染周期兔血清循環抗原。結果固相金納米棒免疫傳感器分別與1～8周的感染血清反應，并設立陰性血清對照組；結果顯示，表面等離子共振吸收峰峰值分別呈現出17 nm，52 nm，28 nm，11 nm，13 nm，23 nm，45 nm，43 nm的位移,陰性對照組未出現位移；同時，根據傳感器表面等離子共振波峰對不同感染周期血清反應后的位移變化推斷抗體在宿主體內呈現出先上升，后下降，再上升的變化規律。結論通過對固相金納米棒免疫傳感器的研究，證明其能夠通過表面等離子共振波峰的移動來檢測日本血吸蟲感染血清循環抗原；同時，對抗原抗體在宿主內的變化提供了數據支撐。固相金納米棒免疫傳感器的高特異性、靈敏度為日本血吸蟲病的診斷及抗原抗體的研究提供了新的手段。

關鍵詞：日本血吸蟲；循環抗原；金納米棒；傳感器

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81271862)，the Key Project of Hunan Province Innovation Platform and Talent Project (Application Basic Research)(No.2015JC3022)，and the Fundamental Research Funds for the Central Universities(No.2012zzts028)

血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種嚴重危害健康的人獸共患寄生蟲病[1]。據世界衛生組織報道[2]，全球仍然有很多地區受到血吸蟲病感染的威脅，特別是在一些公共衛生條件較差、醫學技術較為落后的國家和地區尤為嚴重。近年來，我國公共環境衛生得到了改善，血吸蟲病的疫情也逐漸得到控制，流行區人畜感染率、感染度均逐年降低。目前常規病原學和免疫學診斷方法，其靈敏度已經難以滿足新流行趨勢傳染源監測的需要[3],糞檢法雖是診斷血吸蟲病的“金標準”，但漏檢率高，其敏感性在輕度流行區已大受質疑[4]。如何在血吸蟲病輕度流行區(人畜感染率<1%),針對低感染度人群進行傳染源監測，是開展高靈敏血吸蟲循環抗原檢測方法研究原創的動力，也是目前血吸蟲病防治工作深入的實際需求。

目前，國內外學者研究證明，血吸蟲循環抗原(CAg，circulating antigen)可作為血吸蟲病現癥感染的重要標志，亦可作為病人治療效果的考核指標[5]。但其在血液和體液中的含量極低，導致常規的免疫學方法很難檢測出來。開發高靈敏的檢測方法是當下血吸蟲病流行趨勢。

生物傳感器是一種能夠將生物物質之間的微弱信號轉化成光電信號的檢測系統，常規生物傳感器由固定化的生物敏感材料(如酶、抗體、抗原等生物活性物質)與適當的理化換能器(如電極等)及信號放大裝置構成[6]。生物納米傳感器是基于生物傳感器平臺，采用納米材料的光電特征制備出高效、穩定的傳感器。眾多納米材料中，金納米棒[7](GNRs，gold nanorods)因其具有尺寸小、比表面積大，形貌可控，對周圍介質環境變化較為敏感等特點，加之其合成方法簡單、產率較高、可穩定保存，且具有特殊的光學性質，備受研究者親睞[8]。金納米棒的局部表面等離子共振(LSPR，Localized surface plasmon resonance)現象是自由電子在金納米棒長軸與縱軸的集體震蕩形成表面等離子效應，該現象不僅能夠反應金納米棒長徑比變化，而且也是影響消光峰變化的主要因素。金納米棒傳感器正是利用其局部表面等離子共振特征檢測抗原抗體的反應信號。目前，液相傳感器的應用已經十分的普遍[9-11],但其在純化過程中因反復分散而改變了自身的濃度，從而影響檢測結果；固相金納米棒免疫傳感器利用固相載體將金納米棒組裝于其表面，再與抗原抗體結合進行檢測。本文通過構建固相金納米棒免疫傳感器，并組裝日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原26-28kDa單鏈抗體(SIEA26-28kDaSjscFv)于固相金納米棒免疫傳感器表面，對不同感染周期的日本血吸蟲兔血清進行檢測。

1材料與方法

1.1材料氯金酸(HAuCl4·4H2O,99%)，CTAB (cetyltrimethylammonium bromide,分子量:364.45)，丙烯酰胺均購自美國阿拉丁公司；硼氫化鈉(NaBH4)購自天津化學試劑研究所有限公司；硝酸銀(AgNO3,分子量:169.87)購自化學試劑國藥控股有限公司；抗壞血酸(Ascorbic Acid),TEMED,十二烷基硫酸鈉購自Sigma公司；聚4-苯乙烯磺酸鈉，分子量：70 000 PSS(C8H9NaO3S)n；聚丙烯胺鹽酸鹽，分子量：15 000 PAH(C3H8ClN)n；3-(巰基丙基)三甲氧基硅烷，分子量：196.34 MPTES(C6H16O3SSi)均購自Sigma-Aldrich上海分公司；ITO玻片(型號：7 mm×50 mm×1 mm)購自深圳華南湘城科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2方法

1.2.1金納米棒制備及修飾

1.2.1.1金納米棒的制備[12]往EP管中依次加入7.5 mL 0.1 mol/L 的表面活性劑(CTAB)溶液、0.25 mL 0.01 mol/L 氯金酸溶液，磁力攪拌30 s；隨后逐滴加入0.6 mL 0.1 mol/L硼氫化鈉溶液，磁力攪拌器攪拌3 min，至顏色呈現淺棕色，25 ℃，放置2 h后使用。然后依次加入4.75 mL 0.1 mol/L 的表面活性劑(CTAB)溶液，0.2 mL 0.01 mol/L氯金酸溶液，0.030 mL 0.01 mol/L硝酸銀溶液，0.032 mL 0.1 mol/L抗壞血酸溶液于新的EP管中，翻轉混勻，待溶液完全透明后加入0.01 mL種子液，25 ℃，靜置24 h后使用。

1.2.1.2金納米棒的修飾將制備好的金納米棒溶液分裝成2 mL/管，8 500 r/min，30 min，棄上清；加入1 mL雙蒸水(18.2 MΩ·cm)，充分混勻后，14 000 r/min，10 min，棄上清；加入1 mL，0.5 mmol/L表面活性劑(CTAB)，充分混勻后，14 000 r/min，10 min，棄上清；加入1 mL，5 mmol/L氯化鈉溶液，25 ℃下保持備用。

1.2.2固相金納米棒傳感器的組裝

1.2.2.1ITO玻片清洗及修飾選取特制的ITO玻片若干，并配置Piranha 洗液對玻片表面清洗和修飾；先向玻璃燒杯中倒入30 mL 98%的硫酸，在玻璃棒引流下往燒杯中加入10 mL 30%的雙氧水，邊加邊攪拌，加入完成后待其冷卻至常溫使用；加熱Piranha洗液至沸騰，將ITO玻片放入洗液中，25 min后完成清洗步驟，待其冷卻后取出；新配置Piranha洗液，水浴加熱至70 ℃，放入清洗后的ITO玻片，40 min后完成羥基化修飾步驟，待其冷卻后取出；隨后配置3-(巰基丙基)三甲氧基硅烷溶液(MPTMS)，取10 mL 95%的無水乙醇，再加入1 mL的3-(巰基丙基)三甲氧基硅烷溶液，充分混勻后4 ℃放置，2 h后使用；再將羥基化后的ITO玻片放入預冷的MPTMS溶液中，4 ℃，7 h后完成巰基化修飾；至此，ITO玻片的清洗及修飾完成。

1.2.2.2固相金納米棒免疫傳感器的組裝取純化后的金納米棒溶液(分裝 1 mL/管)，將修飾后的ITO玻片浸入到金納米棒溶液中，25 ℃水浴，放置7 h后，取出，洗凈，干燥，紫外分光光度計檢測。

1.2.3固相金納米棒傳感器表面修飾取出固相金納米棒傳感器(ITO)，雙蒸水反復清洗3次，自然干燥后，先浸入到2 mg/mL的聚4-苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液中30 min，取出，清洗3次，自然干燥；再浸入到2 mg/mL聚丙烯胺鹽酸鹽(PAH)溶液中30 min，取出，清洗3次，干燥后備用。

1.2.4SIEA26-28kDaSjscFv的制備將重組質粒pET43.1a/SjscFv的E.coliBL21(DE3)從-80 ℃冰箱取出，復蘇后劃板，挑選單克隆接種至10 mL LB液體培養基(Amp+,100 μg/mL)中，37 ℃搖床振蕩培養，待其OD600為0.4～0.6之間時停止培養。據本科室報道，PET43.1a/SIEA26-28 kDa-SjscFv質粒的E.coliBL21(DE3)的最佳表達溫度為28 ℃、IPTG最佳誘導時間為16 h，其IPTG最佳誘導濃度為0.05 mmol/L。在此條件下，我們進行蛋白的大量誘導表達。隨后進行離心，4 ℃ 8 000 r/min，10 min后獲得菌體沉淀，棄除上清液，用PBS洗滌沉淀；然后繼續離心，棄上清。再將沉淀置于-80 ℃冰凍30 min，37 ℃水浴3 min，反復凍融3～5次，根據菌體量加入適量PBS，在冰浴條件下進行超聲破碎，1 mL PBS重懸液設定工作4 s，間隔6 s，15次，功率180 W。設定4 ℃，12 000 r/min高速離心15 min，棄上清，沉淀，-20 ℃保存備用。

1.2.5SIEA26-28kDaSjscFv與金納米棒傳感器的結合及條件優化從-20 ℃冰箱中取出1 mL SIEA26-28kDaSjscFv,待完全溶解后室溫放置備用。取干燥的ITO-金納米棒玻片，將其浸入到SIEA26-28kDaSjscFv溶液中，常溫下，分別反應30 min，2 h，4 h，6 h后，利用紫外分光光度計檢測不同時間段的吸光值，記錄結果。

1.2.6檢測不同感染周期陽性兔血清循環抗原取1.5～2 kg的家兔，并將其仰面固定于兔臺上，剃除腹部體毛，以去氯水濕潤皮膚，將粘有尾蚴的蓋玻片(500±10尾/只)覆于其上，保留15 min，完成感染。分別取感染1～8周的陽性兔血清各2 mL，將帶有SIEA26-28kDaSjscFv單鏈抗體的固相金納米棒免疫傳感器分別浸入到不同感染周期的血清中，4 ℃ 2 h，隨后將固相金納米棒傳感器取出，反復沖洗3次，自然干燥后，進行紫外分光光度檢測。

2結果

2.1金納米棒溶液表面等離子共振圖譜和掃描電鏡圖本文采用晶種子生長法成功制備出了橫波峰為550 nm,縱波峰為785 nm的金納米棒溶液，見圖1，掃描電鏡結果顯示其長徑比為3.2，見圖2。

圖1　金納米棒溶液紫外分光光度計圖譜 Fig.1　UV-Vis absorption spectrum of chemically synthesized gold nanorods showing a transverse surface plasmon resonance at 550 nm and longitudinal resonance at 785 nm

圖2　金納米棒溶液掃描電鏡圖Fig.2　SEM image of monodispersed GNRs in solution

2.2固相金納米棒傳感器的表面等離子共振圖譜

金納米棒通過金硫共價鍵組裝到ITO玻片表面，進行紫外分光光度計檢測，結果顯示其在689 nm處有吸收峰值，見圖3。

圖3　固相(ITO)金納米棒表面等離子共振光譜Fig.3　UV-Vis absorption spectrum of surface of solid phase (ITO) gold nanorod

2.3ITO-金納米棒傳感器與單鏈抗體組裝時間優化結果通過觀察常溫下不同時間點單鏈抗體ScFv與ITO-金納米棒表面結合后，其表面等離子共振圖譜的變化進行分析，見圖4。結果發現：在未結合ScFv時，其吸收峰在713 nm(黑色曲線)；30 min后，其曲線紅移至727 nm(紅色曲線)；2 h后該曲線紅移至753 nm(藍色曲線)；4 h后該曲線未出現移動(梅紅色曲線)；6 h后該曲線仍然未有移動出現(綠色曲線)。

2.4固相金納米棒免疫傳感器檢測日本血吸蟲不同感染周期的陽性兔血清采用固相金納米棒免疫傳感器對不同感染周期的陽性兔血清進行檢測(如圖5)。結果顯示，不同感染周期的陽性血清與固相金納米棒免疫傳感器結合后，其吸收峰縱波峰呈現出不同程度的位移，如17 nm(感染1周)，52 nm(感染2周)，28 nm(感染3周)，11 nm(感染4周)，13 nm(感染5周)，23 nm(感染6周)，45 nm(感染7周)，43 nm(感染8周，見圖5A-H)，而橫波峰結合前后沒有任何移動；陰性血清與固相金納米棒免疫傳感器結合后并未發生任何移動，見圖5I。

圖4　ITO-金納米棒與單鏈抗體ScFv不同結合時間段的吸收峰峰值變化Fig.4　Changed of UV-Vis absorption spectrum of ITO-gold nanorods after assembly with ScFv

(A)感染1周的陽性血清(位移：17 nm)；(B)感染2周的陽性血清(位移：52 nm)；(C)感染3周的陽性血清(位移：28 nm)；(D)感染4周的陽性血清(位移：9 nm)；(E)感染5周的陽性血清(位移：13 nm)；(F)感染6周的陽性血清(位移：23 nm)；(G)感染7周的陽性血清(位移：45 nm)；(H)感染8周的陽性血清(位移：43 nm)；(I)陰性對照組(沒有任何移動)。(A) Infection serum for 1 week (shift: 17 nm); (B) Infection serum for 2 week (shift: 52 nm); (C) Infection serum for 3 week (shift: 28 nm); (D) Infection serum for 4 week (shift: 9 nm); (E) Infection serum for 5 week (shift: 13 nm); (F) Infection serum for 6 week (shift: 23 nm); (G) Infection serum for 7 week (shift: 17 nm); (H) Infection serum for 8 week (shift: 43 nm);(I)Control group (shift: 0 nm)圖5　金納米棒傳免疫感器檢測不同感染周期的日本血吸蟲感染血清Fig.5　UV-Vis absorption spectrum change before and after reacting with serum from different infection periods by gold nanorod sensor

3討論

本文將日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原單鏈抗體(SIEA26-28kDaSjscFv)成功的組裝到ITO-固相金納米棒免疫傳感器表面。ITO-金納米棒固相免疫傳感器分別與日本血吸蟲陰性和陽性兔血清結合，通過觀察結合前后傳感器表面等離子共振吸收峰峰值的變化，來分析日本血吸蟲循環抗原在宿主體內的變化規律。

構建成功的ITO-固相金納米棒免疫傳感器檢測日本血吸蟲不同感染周期的兔陽性血清。結果顯示，隨著時間的推移，ITO-固相金納米棒傳感器表面等離子共振吸收峰位移呈現出先增加再減小，然后再增加的規律。眾所周知，循環抗原可作為血吸蟲病現癥感染的重要標志，亦可作為活蟲寄生的標志物以及病人治療效果的考核指標。但是血吸蟲循環抗原在宿主體內受到宿主的生理功能和免疫作用后，其質和量都在發生變化。Nash等[13-14]認為宿主清除血吸蟲循環抗原方式有兩種:①抗原與相應抗體結合成免疫復合物,由抗體的Fc段與Fc受體的各種細胞(如巨噬細胞等)結合,通過吞噬作用而消除抗原;②具有半乳糖受體的肝細胞及具有甘露糖和N-乙酰葡萄糖胺受體的巨噬細胞與具有相應成分的抗原結合，可使抗原降解為低分子抗原最終經尿排出體外。本試驗結果顯示，ITO-金納米棒免疫傳感器與感染1周兔陽性血清反應后，其吸光值位移為17 nm，而2周后，其吸光值的位移為52 nm，較其他感染周期的吸光值位移都要大，這可能是由于血吸蟲感染早期釋放的大量循環抗原還未被宿主體內的免疫系統所清除，而與ITO金納米棒免疫傳感器表面的SIEA26-28kDaSjscFv結合，使得其吸光值變化較大；隨著宿主免疫系統識別并消除體內循環抗原的增加，導致感染3周和4周的陽性血清呈現吸光值遞減的現象，而感染5周，6周，7周，8周的陽性血清的吸光值驟增，可能是因為該時間段即產卵高峰期伴有大量的血吸蟲循環抗原產生，導致出現吸光值驟增。該檢測結果與劉世國[15]等應用Dot-ELISA進行日本血吸蟲循環抗原檢測滴度與感染度關系的動態觀察結果一致，但ITO金納米棒免疫傳感器檢測優于前者，能夠檢測到早期感染(14 d)時所釋放于宿主體內的循環抗原。

本文成功構建固相金納米棒免疫傳感器，分別對血吸蟲陽性和陰性血清識別，并且對日本血吸蟲不同感染周期的陽性兔血清進行檢測。結果證實，基于ITO固相金納米棒免疫傳感器是一種能夠識別日本血吸蟲陽性和陰性血清的有效檢測工具，且對早期感染有較好的識別能力。該方法為早期日本血吸蟲病的診斷提供有效的工具的同時，也為其他寄生蟲病的診斷帶來新的思路。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.04.001

通訊作者：汪世平，Email:wsp4373383@126.com

中圖分類號：R383

文獻標識碼:A

文章編號:1002-2694(2016)04-0315-06

Corresponding author:Wang Shi-ping，Email: wsp4373383@126.com

收稿日期：2015-06-11修回日期：2015-11-29

Detection onSchistosomajaponicumcirculating antigen from rabbit serum in different periods using gold nanorod biosensors

HE Xin，WANG Shi-ping，ZHOU Yun-fei，HUANG Cheng-ming，LYUQIU Si-jia，NING Shui-bing

(DepartmentofParasitology，XiangyaSchoolofMedicine，CentralSouthUniversity，Changsha410078，China)

Abstract:In order to detect Schistosoma japonicum circulating antigen and to analyze the change of antibody in host，gold nanorods were prepared by seed-mediated growth and were deposited onto the ITO-glass slide. SIEA26-28k DaSjscFv antibody was bound onto the solid phase sensor and identified from the longitudinal plasmon of the GNRs wavelength shift as the optical signature. The biosensor was used to detect S.japonicum circulating antigens by employing Local Surface Plasmon Resonance (LSPR) changes，which subsequently resulted in better optical recognition of antigen-antibody binding. We demonstrate that the biosensor could accurately distinguish between S.japonicum-positive and -negative serum samples under the same conditions. We detected the infection serum with S.japonicum in different periods (1 to 8 week，respectively)，and the results showed the different red shift was 17 nm，52 nm，28 nm，11 nm，13 nm，23 nm，45 nm and 43 nm respectively，and the change rule of antibody can be provided by these data. Meanwhile，the sensor，with high sensitivity and specificity，can offer a new monitoring method to study the antigen-antibody and diagnosis of schistosomiasis，and also bring new ideas for other parasite prevention and treatment.

Keywords:Schistosoma japonicum; circulating antigens; gold nanorod; sensor

國家自然科學基金(No.81271862),湖南省創新平臺與人才計劃(應用基礎研究)重點項目(No.2015JC3022)，中南大學中央高校基礎研究業務費專項資金(No.2012zzts028)聯合資助