藍氏賈第鞭毛蟲胞外核酸酶的表達純化和活性鑒定

王　沂,趙俊暕，余　源,田喜鳳,李　冀,劉曉莉,周英斌,李少東,王　洋

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藍氏賈第鞭毛蟲胞外核酸酶的表達純化和活性鑒定

王沂1,趙俊暕1，余源2,田喜鳳2,李冀2,劉曉莉2,周英斌2,李少東2,王洋2

1.華北理工大學附屬醫院檢驗科，唐山063000；2.華北理工大學生命科學學院，唐山063000

摘要：目的克隆、原核表達藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia，賈第蟲)的胞外核酸酶編碼區，并對其蛋白產物進行活性鑒定。方法對賈第蟲胞外核酸酶(GeNuc)蛋白進行生物信息學分析，根據分析結果以C2株賈第蟲基因組DNA為模板擴增獲得GeNuc去信號肽段編碼區序列，雙酶切連入原核表達載體pET-28a(+)，將酶切和測序驗證正確的重組質粒轉化E.coli Rosetta(DE3)，經IPTG誘導表達融合蛋白，SDS-PAGE及Western blot鑒定蛋白產物。Ni-NTA親和層析純化GeNuc蛋白，經復性后驗證其對質粒DNA的水解能力。結果成功克隆了長約800 bp的GeNuc編碼區并構建了原核表達載體pET-28a(+)-GeNuc，測序結果顯示C2株GeNuc序列與WB株相同；在大腸桿菌中誘導表達獲得了相對分子量約30.8 kDa的融合蛋白；復性后的純化GeNuc蛋白具有降解雙鏈DNA的能力，但活性較商品化DNaseⅠ低。結論證明了GeNuc的存在，為GeNuc抗體的制備及賈第蟲致病機制的研究提供了實驗材料。

關鍵詞：藍氏賈第鞭毛蟲；胞外核酸酶；生物信息學；原核表達；活性鑒定

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31471954), and the Hebei Province Science Foundation for Youths (No. C2012401039)

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡稱賈第蟲)屬于動鞭毛綱、雙滴蟲目、六鞭毛科、賈第蟲屬，是一種全球分布的機會致病性原蟲，被認為是目前已知的最原始真核細胞，也是生物學研究中重要的模式生物。賈第蟲生活史簡單，僅包括兩個階段，即具有感染能力的包囊和具有運動和繁殖能力的滋養體。人和哺乳動物通過攝入污染賈第蟲包囊的食物或水感染，被吞食的包囊在十二指腸脫囊而成滋養體，滋養體寄生在十二指腸和空腸上部，以吸盤吸附在腸粘膜表面，與宿主競爭營養并機械性損傷腸粘膜，引起以腹痛、腹瀉和吸收不良為主要表現的賈第蟲病，在世界范圍內具有很高的發病率[1]。兒童慢性賈第蟲感染可引起發育障礙，而一些免疫力極度低下的人群，如AIDS患者，則有可能引起致命的腹瀉，賈第蟲也因此成為對人類健康影響最大的機會致病性寄生蟲之一。

對WB株賈第蟲基因組數據庫分析發現，賈第蟲基因組中存在編碼胞外核酸酶的序列，但未經實驗證實。胞外核酸酶是一種能夠降解環境中DNA或RNA的酶類，廣泛存在于從細菌到人類的多種原核和真核生物中，其中病原生物的胞外核酸酶目前研究相對較多，尤其是致病菌的胞外核酸酶。致病菌的胞外核酸酶主要為內切核酸酶，有的種類鑲嵌在細胞膜上，有的則直接分泌到周圍環境中。對于致病菌來說，胞外核酸酶可以用來調節生物被膜上DNA的含量，提供補救合成核苷酸的原料，還有可能參與對抗宿主的免疫應答[2-3]。

關于賈第蟲能否產生具有生物學活性的胞外核酸酶，以及胞外核酸酶有何生物學意義，目前尚無相關報道。本研究克隆、原核表達了C2株賈第蟲胞外核酸酶(GeNuc)蛋白，并對其活性進行了初步鑒定，證明了GeNuc的存在，為GeNuc生物學意義的研究奠定了基礎。

1材料和方法

1.1材料C2株賈第蟲，E.coliTOP10、Rosetta(DE3)，原核表達載體pET-28a (+)均為本實驗室保存。血液基因組提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T4 DNA連接酶購自天根公司；DNaseⅠ購自Promega公司；2×Pfu Master Mix購自近岸公司；限制性內切酶NcoⅠ、XhoⅠ購自NEB公司； DAB顯色試劑盒購自中杉金橋；鼠源抗His-Tag抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體、BCA 蛋白定量試劑盒購自康為世紀；Ni-NTA預裝重力柱購自生工公司；引物合成及測序均由英濰捷基公司完成。

1.2方法

1.2.1GeNuc蛋白的生物信息學分析根據GenBank提供的WB株賈第蟲GeNuc的蛋白序列(XP_001709720.1)進行生物信息學分析，SignalP 3.0 預測信號肽；TMHMM、TMpred、DAS-TMfilter服務器預測跨膜區；NetNGlyc 1.0 預測糖基化位點；InterPro服務器預測該蛋白的功能結構域；PredictProtein服務器分析GeNuc蛋白的二級結構；SWISS-MODEL服務器同源建模預測該蛋白的三維結構。

1.2.2GeNuc編碼區的克隆和重組表達質粒構建根據GenBank中WB株賈第蟲胞外核酸酶GeNuc(XM_001709668.1)編碼區序列，結合SignalP 3.0信號肽預測結果，去除N端信號肽編碼序列設計引物，上游引物(5′- CATGCCATGGGCAAAGA

GAGTCTAGTGAACTCG-3′)和下游引物(5′- CC

GCTCGAGACCACAGAGCGCTTGCTCG-3′)，上下游引物序列中下劃線部分分別為NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點。采用改良TYI-S-33培養基按常規方法培養C2株賈第蟲滋養體并收集蟲體團塊[4]。采用血液基因組提取試劑盒提取C2株賈第蟲基因組DNA。以基因組DNA為模板PCR擴增GeNuc編碼區，反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產物。膠回收產物經限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ酶切后，與經同樣酶切的pET-28a(+)載體混合16 ℃連接反應6 h后轉化E.coliTOP10感受態細胞，涂布50 μg/mL卡那霉素抗性平板篩選。陽性克隆擴大培養提質粒，經雙酶切鑒定正確后送測序分析。

1.2.3重組蛋白的誘導表達和鑒定將驗證正確的重組質粒轉化E.coliRosetta(DE3)，卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(34 μg/mL)雙抗平板篩選陽性克隆，接種單克隆于LB液體培養基中振蕩培養過夜。次日1/100比例轉接于含新鮮雙抗的LB培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600≈0.6，加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導表達5 h，離心收集菌體，2×SDS上樣緩沖液煮沸裂解獲得全菌體蛋白。經SDS-PAGE和Western blot鑒定融合蛋白表達情況。Western blot以鼠源抗His-Tag單抗(1∶1 000)為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG(1∶2 000)為二抗，DAB顯色觀察。

1.2.4GeNuc蛋白的純化、復性和活性鑒定采用1.2.3的方法誘導500 mL菌液，收集菌體沉淀，重懸于碎菌緩沖液，超聲破碎后離心收集沉淀。沉淀洗滌2次后用含8 mol/L尿素、10 mmol/L DTT的變性緩沖液4 ℃搖動過夜溶解包涵體。次日離心收集上清，用Ni-NTA親和層析柱進行純化，具體操作按說明書進行。純化蛋白通過尿素濃度梯度(6、5、4、3、2、1、0.5 mol/L尿素溶液)從高至低4℃透析復性，最后用PBS透析，SDS-PAGE鑒定純化結果，BCA蛋白定量試劑盒檢測純化蛋白濃度。將1 μg pET-28a(+)-GeNuc質粒與1 μg純化復性GeNuc蛋白混合，采用商品化DNaseⅠ緩沖體系，按照DNaseⅠ說明書中單位定義條件于37 ℃反應10 min，瓊脂糖凝膠電泳觀察GeNuc水解DNA的能力。同時設商業化的DNaseⅠ消化及未經消化的質粒DNA分別作為陽性對照和陰性對照。

2結果

2.1GeNuc的生物信息學分析GeNuc的蛋白由272aa組成，分子量約30.78 kDa，SignalP 4.1服務器預測該蛋白N端信號肽包含13個氨基酸殘基，去除信號肽分子量29.52 kDa。TMHMM、TMpred、DAS-TMfilter顯示該蛋白無跨膜區。NetNGlyc 1.0顯示該蛋白有2個可能的糖基化位點(Asn19、Asn143)。InterPro服務器預測GeNuc蛋白第58-220aa為一個內切核酸酶Ⅰ(Endonuclease I)功能域。PredictProtein服務器預測GeNuc蛋白(去除信號肽部分)的二級結構中以無規則卷曲為主，占全部氨基酸的71.81%，α螺旋、β折疊鏈所占比例分別為21.24%、6.95%。SWISS-MODEL服務器選取可信度(100%)和一致性(27.27%)最高，且具有對應PDB 數據的2pu3.1.A(低溫嗜鹽殺鮭弧菌內切核酸酶Ⅰ)作為模版進行GeNuc蛋白空間結構預測，其模建殘基范圍在29-223，包含了GeNuc的功能域全長(圖1)。

圖1　SWISS-MODEL服務器由低溫嗜鹽殺鮭弧菌內切核酸酶Ⅰ蛋白建模的GeNuc蛋白三維模型

2.2GeNuc重組表達質粒的構建以賈第蟲基因組DNA為模板擴增GeNuc編碼區，PCR產物經瓊脂糖電泳可見約800 bp的單一條帶，與預期大小相符(圖2 A)。將GeNuc和pET-28a(+)載體連接后轉化E.coliTOP10，陽性克隆提取質粒進行雙酶切驗證，可見約790 bp和約5 400 bp兩條帶(圖2B)，與預期相符。測序結果證實C2株賈第蟲GeNuc序列與GenBank提供的WB株GeNuc相同，將鑒定正確的重組質粒命名為pET-28a(+)-GeNuc。

2.3GeNuc融合蛋白的誘導表達和鑒定 以未經誘導的pET28a(+)-GeNuc/Rosetta(DE3)菌體裂解物為對照，SDS-PAGE觀察IPTG誘導后重組蛋白表達情況，結果顯示誘導菌可見分子量約30.8 kDa的目的條帶，與預期大小相符，未誘導菌則無此條帶(圖3A)。Western blot結果顯示，僅誘導菌在30.8 kDa大小處出現單一陽性條帶(圖3B)。

2.4GeNuc融合蛋白的純化和活性鑒定采用Ni-NTA親和層析柱從誘導菌包涵體中純化GeNuc融合蛋白，經尿素梯度透析復性，SDS-PAGE鑒定純化產物可見分子量30.8 kDa的單一目的蛋白條帶(圖4A)，表明純化效果良好。復性后的GeNuc蛋白1 μg消化1 μg的pET28a(+)-GeNuc質粒DNA，以1單位的商品化DNaseⅠ作為陽性對照，未消化質粒作為陰性對照，37 ℃反應10 min后電泳可見質粒DNA被GeNuc融合蛋白部分水解，而DNaseⅠ將質粒完全水解(圖4B)。

M：DNA marker; 1：PCR product; 2: Double digestion of recombinant plasmid

M: Standard protein marker; 1: Induced pET28a(+)-GeNuc/Rosetta(DE3); 2: Uninduced pET28a(+)-GeNuc/Rosetta(DE3).

A: SDS-PAGE analysis of purified GeNuc fusion protein. M: DNA marker; 1: Purified fusion protein

3討論

許多原蟲基因組中都存在編碼胞外核酸酶的基因序列，尤其是營寄生生活的原蟲，目前相關研究比較多的是與賈第蟲同屬動鞭毛綱的利什曼原蟲。在不同種類的利什曼原蟲中發現了幾種不同的胞外核酸酶，按照定位不同可以大致分成分泌型和膜結合型兩大類，均屬于I型核酸酶，該型酶同時具有核酸內切酶和3’核苷酸酶兩種活性，可以降解的底物包括RNA、ssDNA、dsDNA[5-13]。目前認為利什曼原蟲胞外核酸酶(Lnuc)主要有兩方面功能。

一是營養作用，同其它原生動物一樣，利什曼原蟲和賈第蟲均缺乏從頭合成嘌呤的酶，因此只能利用吸收進來的核苷或嘌呤通過補救途徑合成嘌呤核苷酸。LNuc可以降解利什曼原蟲生存環境中，即宿主細胞中的核酸，同時發揮兩種酶的活性將核酸降解成核苷，最后由蟲體膜上的轉運體將核苷轉入蟲體用于補救合成。根據生物信息學分析，GeNuc屬于Ⅰ型內切核酸酶，只能降解dsDNA和ssDNA成為核苷酸，本身并不具備將核苷酸分解成能夠吸收的核苷或堿基的能力[6-7,10-11]。但我們對賈第蟲基因檢索發現，賈第蟲基因組中存在編碼可能的5’核苷酸酶的基因，并且序列分析顯示其編碼產物具有信號肽且能夠固定在細胞膜上，此外賈第蟲還存在可能的嘌呤核苷磷酸化酶轉運蛋白及嘌呤透酶，這些酶的協作可能幫助賈第蟲在體外將核酸降解成嘌呤并轉運至蟲體內部。賈第蟲滋養體生存的小腸中也存在宿主分泌的核酸分解代謝的一系列酶類，理論上說小腸寄生狀態的賈第蟲不會缺乏核苷、堿基之類的營養物質，那么賈第蟲保留這樣一套分解胞外核酸的酶系統是否具有營養方面的意義？對GeNuc基因進行敲除以及分析GeNuc在賈第蟲發育不同階段的表達情況將有助于解開這一問題。

LNuc的第二個功能是對抗宿主免疫的作用，主要是對抗宿主免疫細胞產生的胞外誘捕網(ETs)。ETs由包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、肥大細胞在內的多種免疫細胞釋放產生，由疏松化的染色質或線粒體DNA和多種蛋白質組成，ETs以DNA纖維網纏繞、限制病原生物移動，并通過DNA網狀結構上附著的抗菌蛋白殺傷病原生物[14]。相比于普通脫顆粒殺傷方式，ETs介導的殺傷提高了局部抗病原物質的濃度，減少了其彌散造成的組織損害，是一種高效的抗病原固有免疫機制，各種細菌感染以及包括利士曼原蟲在內的部分寄生蟲感染均能誘導ETs的產生并受其殺傷和限制[15-18]。而病原生物的胞外核酸酶能夠降解破壞ETs，這一現象最早在致病菌中發現，已知包括金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌等在內的多種常見致病菌均能產生降解ETs的胞外核酸酶，對病原菌具有明顯的保護作用[19-23]。

LNuc是目前唯一已被證實具有保護意義的寄生蟲胞外核酸酶。在體外實驗中，利什曼原蟲能夠憑借其表面錨定的LNuc以劑量和時間依賴性的方式破壞NETs，具有該酶活性的利什曼原蟲較酶活性抑制的蟲體生存率顯著提高[13-14]。賈第蟲是否能夠誘導ETs生成目前尚無報道。早期的體外實驗證實，中性粒細胞和單核細胞能夠抑制賈第蟲的粘附[24]，并且中性粒細胞源性的抗菌肽和防御素對賈第蟲有較強的殺傷作用[25]。但之后的研究顯示，能夠生成ETs的中性粒細胞、嗜酸性粒細胞在抗賈第蟲免疫中所起的作用似乎比較有限，賈第蟲可以通過干擾上皮細胞釋放炎性因子抑制中性粒細胞的趨化作用[26]，因此輕度的賈第蟲感染通常沒有明顯的炎癥反應。但嚴重的賈第蟲感染時，賈第蟲滋養體可以出現在上皮細胞內、固有層、粘膜下層及肌層，常會引起中性粒細胞和嗜酸性粒細胞在腸粘膜固有層和粘膜下層的浸潤[27-28]，這為ETs的形成創造了條件。GeNuc能否有效的對抗ETs仍有待進一步的體外和體內實驗驗證。

為了表達有活性的GeNuc，我們首先對該酶的蛋白序列進行了生物信息學分析，在克隆該酶編碼基因時去掉了信號肽的編碼序列，以防原核生物不能識別真核蛋白的信號肽剪切位點，殘留信號肽干擾酶活性中心的形成。此外，鑒于賈第蟲缺乏內含子的原始生物學特征，我們直接從賈第蟲基因組DNA中克隆GeNuc基因，較從cDNA中克隆更為方便。最后酶活性的鑒定顯示GeNuc活性較商品化DNaseⅠ要低，但這也有可能是實驗中復性不到位、非最佳反應條件或者未去除His標簽造成的，此外，原核表達系統缺乏糖基化修飾很可能也是一個重要的原因。該蛋白的詳細酶學特征仍需進一步的實驗進行鑒定。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.014

通訊作者：王洋，Email：konig718@163.com

中圖分類號：R382.21

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0065-05

Corresponding author:Wang Yang, Email: konig718@163.com

收稿日期：2015-02-26；修回日期:2015-09-27

Prokaryotic expression and characterization of Giardia lamblia extracellular nuclease

WANG Yi1,ZHAO Jun-jian1,YU Yuan2,TIAN Xi-feng2,LI Ji2,LIU Xiao-li2,ZHOU Ying-bin2,LI Shao-dong2,WANG Yang2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,NorthChinaUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,Tangshan063000,China;2.CollegeofLifeSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Abstract:For many pathogens, extracellular nuclease is requisite for salvaging exogenous nucleosides and defending against immune attack. By searching the genome of Giardia lamblia, we found a provisional extracellular nuclease coding sequence. To express G. lambia extracellular nuclease (GeNuc) in E. coli and characterize its activity, the provisional GeNuc protein sequence of G. lambia WB strain from GenBank was analyzed. The coding sequence of GeNuc without signal peptide was amplified by PCR from genome DNA of G. lamblia C2 strain. Sequencing result showed that GeNuc in C2 strain was identical to that in Giardia WB strain. The PCR product (800 bp in size) was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+). The recombinant vector pET-28a(+)-GeNuc was transformed into E. coli Rosetta(DE3), then the recombinant GeNuc protein was expressed by IPTG induction. SDS-PAGE and Western blot using anti-His Tag antibody showed that the expressed product of GeNuc was a fusion protein about 30.8 kD. The GeNuc recombinant protein, which was purified by Ni-NTA affinity chromatography and renatured by dialysis, showed DNase activity by partially digesting plasmid DNA. The successful prokaryotic expression and characterization of GeNuc provide a prerequisite for antibody preparation and further approach of pathogenesis of Giardiasis.

Keywords:Giardia lamblia; extracellular nuclease; bioinformatics; prokaryotic expression; activity determination

國家自然科學基金(No.31471954)和河北省青年科學基金(No.C2012401039)聯合資助