減毒沙門氏菌投遞的TGEV S基因疫苗口服免疫豬的動態規律

張小會，張　丹，梁恩濤，余　敏，黃小波,2，曹三杰,2，文心田,2，文翼平,2，伍　銳,2

?

減毒沙門氏菌投遞的TGEV S基因疫苗口服免疫豬的動態規律

張小會1,3，張丹1，梁恩濤1，余敏1，黃小波1,2，曹三杰1,2，文心田1,2，文翼平1,2，伍銳1,2

1.四川農業大學動物醫學院，動物傳染病與基因芯片實驗室，雅安625014；2.四川農業大學人獸共患病研究室與豬病防治研究中心，成都611130；3.屏山縣畜牧獸醫局,宜賓645350

摘要：目的研究TGEV S基因疫苗SL7207(PVAXD-TS)口服免疫仔豬后的動態免疫誘導規律。方法將口服疫苗SL7207(PVAXD-TS)、空載體菌株SL7207(PVAXD)以1.6×1011CFU/頭的劑量口服接種20日齡仔豬，以PBS為空白對照，2周后以2.0×1011CFU的劑量加強免疫。分別測定0、2、4、6和8周的血清IgG、IgA、TGEV中和抗體、細胞免疫反應 IL-4、IFN-γ、外周血淋巴細胞增殖情況。結果仔豬口服免疫后第4周即可檢測抗TGEV的特異性IgG和糞黏液IgA抗體；在免疫后第6周IgA、IgG、IL-4、IFN-γ抗體和外周血T淋巴細胞增殖與SL7207(PVAXD)、PBS間均存在統計學差異(P<0.01)，并在第6周達到最高值；中和實驗顯示該疫苗誘導的血清IgG具有中和活性。結論證實以減毒沙門菌為載體的TGEV S基因疫苗口服免疫仔豬有較好的免疫原性。

關鍵詞：豬傳染性胃腸炎；減毒沙門氏菌；S基因；仔豬；免疫原性

Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos. 30901084 & 31072144)

豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenteritis ,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus ,TGEV)引起的一種腸道傳染病，各年齡階段的豬均可感染本病，尤其是2周齡以內的哺乳仔豬最易感，其死亡率高達100%[1]，TGE已給各國養豬業造成了極大危害。目前該病尚無有效的藥物可用于治療，因此，疫苗預防接種仍然是防治該病的最佳選擇。

TGEV的S糖蛋白突出于病毒粒子表面，具有重要的免疫學功能。S 蛋白攜帶主要的B 淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能誘導機體產生中和抗體的結構蛋白[2]。豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白是具有良好免疫原性的結構蛋白，能誘導特異性IgG和黏膜sIgA抗體的產生[3-4]。黃小波等[5]研究的減毒沙門氏菌遞呈的TGEV S/N融合基因疫苗在小鼠體內具有良好的免疫原性，但與TGEV S單基因疫苗相比，差異無統計學意義(P>0.05),且SL7207(pVAX-S/N)干擾素水平低于SL7207(pVAX-S)。多項研究表明TGEV S單基因疫苗具有良好的免疫原性。任曉峰等[6]構建的含TGEVS基因主要抗原位點的DNA疫苗，通過肌肉注射免疫小鼠，可誘導小鼠產生較高水平的IgG和IgA抗體。Ahn等[7]將構建的TGEV S基因轉基因植物疫苗飼喂小鼠，誘導小鼠產生了特異性IgG和IgA抗體。

減毒沙門氏菌作為疫苗載體被廣泛應用各種疫苗的研究中。其所攜帶的外源性抗原基因可在宿主體內有效表達[8]。減毒沙門氏菌作為DNA疫苗載體的顯著優點是能進行口服免疫，刺激機體產生強烈的局部粘膜免疫、體液免疫和細胞免疫[9]。減毒沙門氏菌作為鼠疫疫苗的載體遞呈抗原，誘導小鼠產生高滴度的IgG抗體，表明其具有良好的免疫原性[10]。Yang等[11]構建了旋毛蟲優勢抗原Ts87的重組減毒沙門氏菌菌株，口服免疫小鼠，誘導了全身性Thl/Th2細胞免疫反應和局部黏膜IgA抗體的產生。因此，近年來被廣泛用于新型疫苗的研發。

本研究前期構建了攜帶TGEV S基因的減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) ，經菌株的體外穩定性試驗和小鼠的安全性試驗，證實該菌株具有良好的穩定性與安全性。同時該疫苗口服免疫小鼠后可有效激發小鼠產生抗TGEV的血清IgG、腸道黏膜IgA抗體和IFN-γ[12]。本研究在前期小鼠實驗的基礎上，進一步將該疫苗通過口服免疫仔豬，研究其在仔豬體內的免疫誘導規律，為該疫苗的應用提供參考依據。

1材料與方法

1.1菌株、細胞和動物重組減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) 和SL7207(PVAXD)由四川農業大學動物傳染病實驗室前期構建；Vero細胞和ST細胞由四川農業動物傳染病實驗室傳代保存；15頭20 d齡健康的杜-長-大三元仔豬，購自雅安某豬場。

1.2主要試劑小量質粒抽提試劑盒：OMEGA公司產品；Hind III和KpnI限制性內切酶：寶生物工程(大連)有限公司產品；測定抗體(IgG,和IgA)的ELISA試劑盒，測定細胞因子(IFN-γ、IL-4)的ELISA試劑盒：R&D 公司產品；豬淋巴細胞分離液：TBD天津灝洋公司產品；小牛血清和DMEM培養基：GIBCO公司產品；卡那霉素：Biosharp公司產品；MTT、肝素鈉、ConA ：Amresco公司產品。

1.3復蘇與鑒定將菌株SL7207(PVAXD-TS)與對照菌株SL7207(PVAXD)復蘇接種于5 mL含Kan的LB液體培養基中，37 ℃ ，220 r/min振蕩培養過夜，將過夜培養的菌液涂布于含Kan的LB瓊脂平板培養16～20 h。挑取SL7207(pVAXD-TS)和SL7207(PVAXD)的單菌落接種于5 mL含Kan的LB液體培養基中，37 ℃， 220 r/min振蕩培養過夜。按OMEGA公司去內毒素質粒提取試劑盒說明書提取質粒，進行PCR與酶切鑒定。

1.4口服疫苗制備選取鑒定后的重組減毒沙門氏菌SL7207(PVAXD-TS) 和對照組SL7207(PVAXD)的單菌落接種于5 mL含100 μg/mL的Kan的LB液體培養基中，37 ℃， 220 r/min振蕩培養過夜。將過夜培養的菌液按照1∶100比例接種于2 000 mL含Kan的LB液體培養基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養至OD600值約為0.8左右。4 000 r/min離心5 min后收集菌體，用含5%NaHCO3的滅菌PBS調整菌液濃度至2×1010CFU/mL。

1.5口服免疫將15頭仔豬隨機分成3組，每組5頭，分別為實驗組SL7207(PVAXD-TS) 、對照組SL7207(PVAXD)和PBS，仔豬免疫前禁食禁水5 h，免疫后禁食禁水2 h。口服免疫仔豬，SL7207(PVAXD-TS) 和SL7207(PVAXD)以每只1.6×1011CFU的劑量進行初次免疫，2周后以2.0×1011CFU的劑量進行加強免疫，共免疫2次，PBS組飼喂含5%NaHCO3的PBS，其余相同。每天觀察仔豬精神、食欲、飲欲、糞便等情況，連續觀察至第8周。

1.6樣品收集

1.6.1血液樣品在首免后第0、2、4、6和8周分別采集每頭豬的血液3 mL，一部分血液加入肝素納抗凝，用于測定外周血T淋巴細胞的轉化率，剩余部分分離血清于-20 ℃保存備用。

1.6.2糞便黏液樣品肛拭棉法取糞便樣品，做好標記。樣品逐個加入200 μL 0.01 mol/L的PBS浸泡肛拭棉，4 ℃作用1.5 h，離心收集上清液，-20 ℃保存待檢。

1.7免疫相關指標檢測

1.7.1特異性血清IgG和黏膜IgA的測定參照ELISA試劑盒說明書測定血清IgG和IgA，主要步驟：1)ELISA實驗設置標準品、待測樣本和空白孔，標準品孔對應加入2倍稀釋的標準液；樣本孔加待測仔豬血清10 μL，樣本稀釋液40 μL，吹打混勻；2)加入HRP標記的二抗50 μL，37 ℃恒溫箱溫育1 h；3)棄去酶標板中的液體，加入稀釋的洗滌液，洗滌5次，拍干；4)加入底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光15 min；5)加入終止液50 μL，反應10 min；6)450 nm波長下測定各孔OD450值。

1.7.2豬 IL-4和IFN-γ水平檢測參照ELISA試劑盒說明書測定血清IL-4和IFN-γ，主要步驟同1.7.1，不同之處是：檢測IL-4時待測樣品孔加入待測仔豬血清40 μL，抗-IL-4抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL；測IFN-γ時加入抗IFN-γ抗體，鏈霉親和素-HRP 50 μL。

1.7.3外周血T淋巴細胞實驗1)采用一次性注射器無菌采集仔豬前腔靜脈血液，于滅菌的已加入肝素鈉的4 mL離心管內，取肝素鈉抗凝血緩慢加于淋巴細胞分離液上，采用淋巴細胞分離液密度梯度離心法(2 000 r/min，12 min)分離外周血淋巴細胞，收集淋巴細胞；用PBS緩沖液洗滌2次，再用不完全RPMIl640洗滌1次，最后用完全RPMI1640將細胞稀釋成5×106個/mL。2)取100 μL淋巴細胞懸液加入96 孔細胞培養板，每個樣品重復3孔；加入終濃度為25 μg/mL 的ConA，置培養板于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養68 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)，10 μL，繼續培養4 h后每孔加入DMSO 100 μL，培養2 h，于490 nm波長處測定其OD490值。

1.7.4中和實驗按常規方法培養ST細胞，接種TGEV病毒，按Reed-Muench法計算出TGEV TCID50。將采集的第6周的仔豬血清56 ℃處理30 min，-80 ℃保存備用。將密度為1×105個/孔的ST細胞接種于24孔細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2條件下培養至長成單層細胞。將滴度為100TCID50的TGEV分別與1∶4，1∶16，1∶64,1∶256，1∶1 024稀釋的血清37 ℃，作用1 h，將混合物接種到單層細胞上，每個孔重復4次，同時設細胞對照和病毒對照，置于37 ℃ 5% CO2細胞培養箱中培養，逐日觀察，統計出現CPE和未出現CPE的細胞孔數，計算血清的中和抗體效價。

1.8數據處理數據的分析處理用SPSS Statistic17.0軟件。

2結果

2.1復蘇鑒定將菌株SL7207(PVAXD-TS)復蘇培養，提取質粒PVAXD-TS分別進行PCR和酶切鑒定，結果PCR擴增出約1 900 bp的條帶，與預期的TGEV S抗原基因(1 896 bp)大小相符(見圖1A)；用Hind III和KpnI對pVAXD-TS雙酶切，可切出與預期大小相符的目的片段約(1 900 bp)和載體片段(3 800 bp)(見圖1)。

M: DNA Marker; lane1, 2: S gene fragment of TGEV amplified by PCR from pVAXD-TS; lane 3: negative controls; lane 4: plasmid pVAXD-TS digested by Hind III / KpnI.

2.2TGEV特異性抗體的動態變化免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)刺激產生的特異性抗體水平IgG、IgA均有所上升，在免疫后第4周特異性抗體含量與對照組SL7207(pVAXD)、PBS間差異存在統計學意義(P<0.01)；在第6周抗體含量達到最高值，其中TGEV IgG達(129.24±5.27) ng/mL,(圖2A)，IgA達(80.88±5.37) ng/mL(2B)；免疫后第8周抗體水平下降。

2.3仔豬血清γ-干擾素和IL-4水平動態變化免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)刺激產生的IFN-γ含量有所上升; 免疫后第4周IFN-γ含量顯著高于免疫前和對照組SL7207(pVAXD)、PBS(P<0.01)；免疫后第6周達到最高值(497.07±36.02 pg/mL)；免疫后第8周，IFN-γ含量有所下降(圖3A)。IL-4檢測結果顯示：免疫后第2周，免疫組IL-4含量有所上升；免疫后第4周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)IL-4含量與SL7207(pVAXD)、PBS和免疫前相比差異極顯著(P<0.01)；免疫后第6周IL-4含量達到最高峰(289.16±3.44 pg/mL)；免疫后第8周，IL-4含量有所下降(圖3B)。

A: serum IgG level; B: feces mucosal IgA level.

A: interferon-γ level; B: IL-4 level.

2.4仔豬血液T淋巴細胞增殖的動態規律免疫后第2周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)對外周血T淋巴細胞的刺激作用開始增強，在4～6周間增長最快，到第6達到最高值；免疫后第6周，免疫組SL7207(pVAXD-TS)與對照組SL7207(pVAXD)和PBS間有極顯著差異(P<0.01)；免疫后第8周，免疫組T淋巴細胞增殖水平有所下降。整個免疫過程中，SL7207(pVAXD)和PBS對照組對淋巴細胞均無明顯刺激作用，一直處于較低水平(圖4)。

2.5疫苗誘導的TGEV中和抗體動態變化采集免疫后第6周的仔豬血液，分離血清，采用固定病毒稀釋血清的方法測定血清中和效價。中和實驗結果顯示，隨血清稀釋度的增加其病毒抑制力明顯下降，在血清稀釋度為1∶4～1∶64之間具有較強的中和活性，且與對照組SL7207(pVAXD)和PBS間存在統計學差異(P<0.01)。由統計結果計算出SL7207(pVAXD -TS)的中和效價為10-1.58(1∶38.02)，顯示了較好的中和活性(見圖5)。

圖4　仔豬外周血T淋巴細胞增殖水平

3討論

減毒沙門氏菌的顯著優點是能夠作為黏膜免疫載體，進行黏膜免疫接種，其在誘導機體產生黏膜免疫反應方面有著不可比擬的優越性[10]。以減毒沙門氏菌為載體構建的多種疫苗均能夠誘導機體產生特異性體液免疫和粘膜免疫反應[13]，產生較高的IgG和IgA抗體[14-15]。目前，關于乳酸菌作為 TGEV疫苗載體開展口服免疫研究的報道也較多[16]。Liu[17], Ho等[18]，Tang等[19]構建的TGEV S基因的乳酸菌疫苗，免疫小鼠均能誘導產生良好的免疫反應，但誘導的特異性抗體含量均遠低于本研究以沙門氏菌為載體的疫苗的免疫結果。上述結果表明，以減毒沙門氏菌為載體的口服疫苗具有良好的免疫應答，且減毒沙門氏菌作為TGEV DNA疫苗載體可能比乳酸菌更具優勢。

圖5　抗TGEV中和抗體檢測

TGE主要通過腸道感染豬體，豬小腸是TGEV的重要靶器官。腸道局部粘膜免疫對阻止TGEV的侵入具有極其重要的作用，腸道分泌型 IgA(sIgA)抗體在抗TGEV感染中發揮主要作用[20]。口服免疫主要是通過胃腸黏膜進行抗原遞呈，進而刺激腸道產生局部粘膜免疫應答。因此，選擇一種能刺激腸道產生IgA抗體的免疫途徑符合TGEV的感染機理。目前，關于口服免疫有效激發機體產生免疫應答的報道較多[21]。趙德[22]等將PEDV S(C-COE)重組乳酸菌疫苗通過口服和肌肉注射兩種途徑免疫小鼠，結果表明口服比肌肉注射更容易吸收，產生較高水平的抗體。本研究結合TGEV腸道粘膜免疫機理，采用口服途徑接種仔豬，免疫后第2周即能檢測腸道分泌型IgA抗體和血清IgG抗體。本研究結果表明，口服免疫能夠誘導仔豬產生針對TGEV的體液免疫和細胞免疫應答。

TGEV S基因疫苗的免疫原性研究前期多在小鼠體內進行[5,12]，不能反應其在本種動物體內的免疫原性。本研究中，SL7207(pVAXD-TS)能夠誘導仔豬產生較強的體液免疫和細胞免疫應答。根據檢測結果比較發現，該疫苗誘導產生的特異性抗體含量，特別是IgG 抗體含量遠大于Ho[18]和Liu[17]等報道的特異性抗體含量。同時，SL7207(pVAXD-TS)誘導的抗TGEV中和抗體在血清稀釋度為1∶4時，病毒抑制率為100%，高于文獻Liu[17,19]等報道的血清稀釋度為1∶2時，病毒抑制率為100%。此外，本研究測定的細胞因子含量(IL-4、IFN-γ)和MTT值均遠高于此前文獻的相關報道[23-25]，但IFN-γ含量低于黃小波等[6]報道。這可能與動物模型、免疫劑量、基因片段、長度等有關。

本研究結果顯示，重組沙門氏菌SL7207(pVAXD-TS)在仔豬體內誘導的免疫動態規律與小鼠基本相似[12]。該疫苗口服免疫妊娠母豬和其他年齡階段豬只能否像仔豬一樣產生明顯的細胞免疫、體液免疫和局部黏膜免疫應答需要進一步研究。此外，本研究為了闡明疫苗的動態免疫規律，為了避免仔豬日齡過小產生應激發病而影響試驗，特選用了20日齡左右的仔豬，由于免疫周期長達8周，當研究結束時仔豬日齡已達到70日齡左右，此日齡段的仔豬可感染TGEV但通常無明顯癥狀，所以本研究未進行攻毒保護試驗，而是以體外抗體中和試驗進行間接評價疫苗效果。在本研究基礎上，后續將開展母豬的口服免疫抗體監測，同時以產房一周內的仔豬進行攻毒保護試驗，以更貼近臨床發病實際情況來科學評價該疫苗的免疫保護效果。

參考文獻：

[1]Mateos-Gomez PA, Zuniga S, Palacio L, et al. Gene N proximal and distal RNA motifs regulate coronavirus nucleocapsid mRNA transcription[J]. J Virol, 2011, 85(17): 8968-8980. DOI: 10.1128/JVI.00869-11

[2]Jimenez G, Correa I, Melgosa MP, et al. Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization[J]. J Virol, 1986, 60(1): 131-139. DOI: 10.1007/978-1-4684-1280-2_44

[3]Tang F, He KW, Hou JB, et al. Construction and immunization of recombinant adenovirus expressing the B, C antigenic sites of spike gene from transmissible gastroenteritis virus(TGEV)[J]. J Agr Biotechnol, 2009, 17(1): 1-6.(in Chinese)

唐芳, 何孔旺, 侯繼波, 等.豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV) S 蛋白 5′ 端基因重組腺病毒的構建及其免疫特性[J]. 農業生物技術學報, 2009(1): 1-6.

[4]Tuboly T, Nagy E. Construction and characterization of recombinant porcine adenovirus serotype 5 expressing the transmissible gastroenteritis virus spike gene[J]. J General Virol, 2001, 82(1): 183-190. DOI: 10.1099/0022-1317-82-1-183)

[5]Huang XB, Zhang XM, Cao SJ, et al. Immunogenicity of attenuatedSalmonellatyphimuriumharbouring S/N fusion gene of porcine transmissible gastroenteritis virus[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(6): 594-600.(in Chinese)

黃小波, 張鑫淼, 曹三杰, 等.減毒沙門氏菌遞呈的TGEVS/N 融合基因疫苗的口服免疫原性[J]. 中國人獸共患病學報, 2013，29(6): 594-600.

[6]Ren XF, Yin JC, Si W, et al. Construction of nucleic acid vaccines containing S gene from TGEV isolate TH-98 and their immune effect in mice[J]. Vet Sci China, 2006, 36(03): 203-206.(in Chinese)

任曉峰，尹杰超，司微，等.豬傳染性胃腸炎病毒TH-98株S基因核酸疫苗的構建及其免疫效力[J].中國獸醫科學, 2006. 36(3): 203-206.

[7]Ahn DJ, Youm JW, Kim SW, et al. Expression of the S glycoprotein of transmissible gastroenteritis virus(TGEV) in transgenic potato and its immunogenicity in mice[J]. Korean J Vet Res, 2013, 53(4): 217-224. DOI: 10.14405/kjvr.2013.53.4.217

[8]Staats HF, Jackson RJ, Marinaro M, et al. Mucosal immunity to infection with implications for vaccine development[J]. Curr Opin Immunol, 1994, 6(4): 572-583. DOI: 10.1016/0952-7915(94)90144-9

[9]Han YW, Kim SB, Rahman M, et al. Systemic and mucosal immunity induced by attenuatedSalmonellaentericaserovar Typhimurium expressing ORF7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J]. Comparat Immunol Microbiol Infect Dis, 2011, 34(4): 335-345. DOI: 10.1016/j.cimid.2011.04.001

[10]Sizemore DR, Warner EA, Lawrence JA, et al. Construction and screening of attenuated ΔphoP/QSalmonellatyphimuriumvectored plague vaccine candidates[J]. Human Vaccines Immunotherapeutics, 2012, 8(3): 371-383. DOI:10.4161/hv.18670

[11]Yang YP, Zhang ZF, Yang J, et al. Oral vaccination with Ts87 DNA vaccine delivered by attenuatedSalmonellatyphimuriumelicits a protective immune response againstTrichinellaspiralislarval challenge[J]. Vaccine, 2010, 28(15): 2735-2742. DOI: 10.1016/j.vaccine .2010.01.026

[12]Liao XD. The oral immunization of attenuatedSalmonellatyphimuriumpresent DNA vaccine of PEDV and TGEV S double-genes[D].Ya'an: Sichuan Agricultural University, 2012.(in Chinese)

廖曉丹. 減毒沙門氏菌遞呈 PEDV/TGEV 雙基因核酸疫苗研究[D].雅安：四川農業大學, 2012.

[13]Liu JY, Zhang SW, Qi JD, et al. Immunogenicity of a tuberculosisSalmonellatyphimuriumvaccine expressing a fusion protein HspX-ESAT6 in mice[J]. J Anim Vet Adv, 2013, 12(4): 458-463.

[14]Cheng M, He J, Fu Y, et al. Antibody responses induced by mucosal DNA vaccine encoding the codon-optimized F protein of human respiratory syncytial virus(RSV) delivered with attenuated Salmonella typhimurium[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2011, 51(7): 965-971.

[15]Yang H, Cao SJ, Huang XB, et al. Intragastric administration of attenuatedSalmonellatyphimuriumharbouring transmissible gastroenteritis virus(TGEV) DNA vaccine induced specific antibody production[J]. Vaccine, 2009, 27(37): 5035-5040. DOI: 10.1016/j.vaccine .2009.06.050

[16]Tang LJ, Ou D, Ge JW, et al. Construction of recombinantLactococcuslactisexpressing porcine transmissible gastroenteritis spike glycoprotein and analysis of immunogenicity[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47(2): 340-344.(in Chinese)

唐麗杰, 歐笛, 葛俊偉.表達豬傳染性胃腸炎病毒S基因的重組乳酸乳球菌的構建及免疫原性分析[J]. 微生物學報, 2007，47(2): 340-344.

[17]Liu DQ, Qiao XY, Ge JW, et al. Construction and characterization ofLactobacilluspentosusexpressing the D antigenic site of the spike protein of transmissible gastroenteritis virus[J]. Canadian J Microbiol, 2011, 57(5): 392-397.

[18]Ho P, Kwang J, Lee Y. Intragastric administration ofLactobacilluscaseiexpressing transmissible gastroentritis coronavirus spike glycoprotein induced specific antibody production[J]. Vaccine, 2005, 23(11): 1335-1342. DOI: 10.1016/j.vaccine .2004.09.015

[19]Tang LJ, Li YJ. Oral immunization of mice with recombinantLactococcuslactisexpressing porcine transmissible gastroenteritis virus spike glycoprotein[J]. Virus Genes, 2009, 39(2): 238-245. DOI: 10.1007/s11262-009-0390-x

[20]Shirato K, Maejima M, Matsuyama S, et al. Mutation in the cytoplasmic retrieval signal of porcine epidemic diarrhea virus spike(S) protein is responsible for enhanced fusion activity[J]. Virus Res, 2011, 161(2): 188-193. DOI: 10.1016/j.virusres.2011.07.019

[21]Hou XL, Yu LY, Liu JZ. Development and evaluation of enzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid protein for detection of porcine epidemic diarrhea(PEDV) antibodies[J]. Vet Microbiol, 2007, 123(1): 86-92.

[22]Zhao D, LI P, Gao FS, et al. Immunization of PEDV recombinantLactococcuslactisto mouse[J].Progr Vet Med, 2013, 34(3)：6-9.(in Chinese)

趙德，李鵬，高鳳山，等.豬流行性腹瀉病毒乳酸菌載體疫苗對小鼠初步免疫試驗[J]. 動物醫學進展, 2013，34(3)：6-9.

[23]Meng FD, Ren YD, Suo SQ, et al. Evaluation on the efficacy and immunogenicity of recombinant DNA plasmids expressing spike genes from porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus[J]. PLoS One, 2013, 8(3): e57468. DOI: 10.1371/journal.pone.0057468

[24]Liu Y. Immunization of recombinantLactococcuslactisexpressing transmissible gastroenteritis virus S gene to mouse and newborn piglets[D].Changchun: Jilin Agricultural University, 2011.(in Chinese)

劉義. TGEV S 基因重組乳酸菌對小鼠和初生仔豬的口服免疫研究[D].長春：吉林農業大學， 2011.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.008

通訊作者：黃小波，Email：rsghb110@126.com

中圖分類號：S855.3

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0033-06

Corresponding author:Huang Xiao-bo, Email: rsghb110@126.com

收稿日期：2014-12-09；修回日期:2015-11-07

Dynamic oral immuno-induction regulation of attenuated Salmonella typhimurium harboring DNA vaccine expressing S gene of transmissible gastroenteritisvirus in piglets

ZHANG Xiao-hui1,3,ZHANG Dan1,LIANG En-tao1,YU-Min1,HUANG Xiao-bo1,2,CAO San-jie1,2,WEN Xin-tian1,2,WEN Yi-ping1,2,WU Rui1,2

(1.LaboratoryofAnimalInfectiousDiseaseandMicroarray/KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Ya'an625014,China;2.LaboratoryofZoonosisandPigDiseasePreventionResearchCenter,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China;3.PingshanCountyAnimalHusbandryandVeterinaryBureau,Yibin645350,China)

Abstract:To develop the dynamic immune regulation of oral vaccine SL7207(pVAXD-TS) in piglets, 20-day-old piglets were orally immunized with SL7207(pVAXD -TS) and SL7207(pVAXD) at a dosage of 1.6 × 1011CFU per piglet, PBS was used as blank control. The booster immunization was done at a dosage of 2.0×1011CFU after 2 weeks. Virus neutralization assay, the specific serum IgG, intestinal mucosal IgA, IFN-γ assay, IL-4 assay, T lymphocyte proliferation assay were respectively performed at 0, 2, 4, 6, 8 weeks. Results showed that SL7207(pVAXD-TS) could induce specific IgG and IgA antibody after four weeks post immunization, and the level of IgA, IgG, IL-4, IFN-γ, and T lymphocytes proliferation were significantly higher(P<0.01) than SL7207(pVAXD) and PBS at 4 weeks; they reached a peak at 6 weeks. Meanwhile, virus neutralization assay showed that serum IgG had a good neutralization activity. It is suggested that the attenuated Salmonella typhimurium harbouring TGEV S gene have a good oral immunogenicity in piglets.

Keywords:Transmissible gastroenteritis; attenuated Salmonella typhimurium; S gene; oral immunogenicity; piglets; immunogenicity

國家自然科學基金項目(No.30901084; No.31072144)