細粒棘球蚴和多房泡球蚴在人體內蛋白質表達譜初步分析

張耀剛，李超群，毋德芳，曹得萍

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細粒棘球蚴和多房泡球蚴在人體內蛋白質表達譜初步分析

張耀剛，李超群，毋德芳，曹得萍

青海大學醫學院病原生物教研室，西寧810001

摘要：目的初步掌握流行于青海省細粒棘球絳蟲幼蟲棘球蚴(原頭節、囊壁、囊液)和多房棘球絳蟲幼蟲泡球蚴在中間宿主人體內蛋白質表達情況。方法利用SDS-PAGE和 Western-blot分析棘球蚴原頭節、囊壁、囊液蛋白質和泡球蚴總蛋白表達譜。結果細粒棘球蚴原頭節的蛋白質濃集在分子量72 kDa處，囊壁的蛋白質濃集在72 kDa、26 kDa和17 kDa 處，囊液的蛋白濃集在72 kDa、43～55 kDa、26 kDa和17 kDa；泡球蚴總蛋白質濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處。結論不同地區細粒棘球蚴在人體內蛋白的表達存在差異；不同亞種泡球蚴原頭節蛋白的表達存在差異。

關鍵詞：細粒棘球蚴；多房泡球蚴；蛋白質表達譜

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棘球蚴病(Echinococcosis)，俗稱包蟲病，是一種由棘球絳蟲的幼蟲寄生于動物和人體內而引起的人獸共患寄生蟲病[1]。我國最常見的是細粒棘球蚴感染所致的囊型包蟲病和多房棘球蚴感染所致的泡型包蟲病。由于兩種絳蟲是同屬，存在多種共同抗原組分，在免疫診斷中存在交叉反應，從而給兩種疾病的鑒別診斷帶來困難[2]。分析棘球蚴和泡球蚴的蛋白表達譜有助于了解棘球蚴和泡球蚴的抗原成分,為抗包蟲疫苗的研制提供基礎數據支持。而目前分析細粒棘球蚴原頭節、囊壁、囊液和多房棘球蚴總蛋白表達譜的研究鮮有報道。本研究擬運用SDS-PAGE和 Western-blot技術對細粒棘球蚴原頭節、囊壁、囊液和多房泡球蚴總蛋白質成分進行初步研究，分析棘球蚴和泡球蚴總蛋白質表達情況，為深入了解細粒棘球絳蟲幼蟲和多房棘球幼蟲的蛋白代謝途徑以及發育過程奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗標本本實驗所用人體包蟲病標本來源于青海省西寧市各大醫院外科手術病人。

1.2細粒原頭節、囊壁和囊液總蛋白的制備

1.2.1原頭節總蛋白的制備取0.5 mL原頭節(約5 000個)加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60周，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查原頭節已破碎完全，4 ℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存備用。

1.2.2囊壁總蛋白的制備剪取大約2 g棘球蚴囊壁用0.1 mol/L PBS液洗滌3次，剪碎，加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60 W，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查囊壁已破碎完全，4℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存備用。

1.2.3囊液總蛋白的制備取2 mL的棘球蚴囊液，4 ℃，12 000×g離心30 min。取上清，-80 ℃保存備用。

1.3泡球蚴總蛋白的制備剪取泡球蚴標本0.5 g加入2 mL非變性蛋白裂解液(40 mmol/L Tris-HCl、適量蛋白酶抑制劑)，振蕩混勻。冰上超聲粉碎2 min(60 W，每次30 s，間隔10 s)，4 ℃振蕩3 h,以使組織充分裂解，顯微鏡下檢查組織已破碎完全，4 ℃，12 000×g離心40 min。取上清，-80 ℃保存備用。

1.4SDS-PAGE和Western-blot使用SDS-PAGE和Western-blot分析棘球蚴原頭節、囊壁和囊液及泡球蚴總蛋白質表達譜，使用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天試劑公司) 測定蛋白濃度，并將各樣本濃度稀釋至相同，SDS-PAGE上樣量為15 μL；采用本室保存的棘球蚴和泡球蚴患者血清進行Western-blot分析。

2結果

2.1利用SDS-PAGE分析細粒棘球蚴原頭節、囊壁和囊液總蛋白質的蛋白表達譜采用本室保存的棘球蚴患者血清進行Western-blot分析。原頭節的蛋白質濃集在分子量72 kDa處，囊壁的蛋白質濃集在72 kDa、26 kDa和17 kDa 處，囊液的蛋白濃集在72 kDa、43～55 kDa、26 kDa和17 kDa。結果詳見圖1。

W: cyst wall; F: cyst fluid; P: protoscolices.

2.2利用SDS-PAGE分析多房棘球絳蟲幼蟲泡球蚴總蛋白質的蛋白表達譜，采用本室保存的泡球蚴患者血清進行Western-blot分析。蛋白質濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處。結果詳見圖2。

圖2　泡球蚴總蛋白質的蛋白表達譜的SDS-PAGE和Western-blot

3討論

蛋白質在細胞中有多種功能，包括結構上的支持作用、構成收縮系統以及參與分子轉運，它們有的作為激素、有的作為毒素，更多的具有抗原性；另一些尤其是免疫球蛋白是免疫系統的關鍵組分。另外一個大的群體酶，能夠催化細胞中的蛋白質基本合成和降解反應。

細粒棘球蚴原頭節、囊壁、囊液的蛋白主要濃集于72 kDa，這與Li[3]等的研究結果是一致的,但三者之間也存在著一定的差異，囊壁的蛋白質除72 kDa外，在26 kDa和17 kDa處也有表達，而囊液的蛋白在43-55 kDa、26 kDa和17 kDa均有表達。顯示出囊液的表達譜更寬。Wang XY[4]等所研究的細粒棘球蚴14-3-3蛋白質的分子量為24-33 kDa，與本研究的結果囊壁和囊液26 kDa的蛋白質是比較接近的。而Zhang Q[5]等對寧夏細粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳結果顯示蛋白質主要分布在43-97.4 kDa 與 14.0 kDa，與本研究結果略有差異，本次研究發現，細粒棘球蚴囊液在26 kDa處亦有表達，這可能是由于生存環境的不同導致細粒棘球蚴囊液的蛋白的表達出現差異，也可能是不同基因型之間囊液蛋白的表達存在差異，這還有待進一步研究。

本研究多房泡球蚴總蛋白濃集在分子量72 kDa、55～72 kDa和26 kDa處，與Cao Y[6]、Ueno M[7]的結果差異不大，而內蒙古歐洲多房棘球絳蟲原頭節蛋白的分子量為10～120 kDa，表達范圍更廣[8]，表明不同亞種泡球蚴原頭節蛋白的表達存在差異。

本研究中Western-blot鑒定的蛋白質均為總蛋白，打算在以后的研究中通過二維電泳和質譜分析技術鑒定更全面的有關棘球蚴原頭節、囊壁、囊液蛋白質點的表達譜。進一步研究在棘球蚴原頭節、囊壁、囊液中表達的這些蛋白質對棘球蚴生命代謝的影響，將為在蛋白質水平上探索治療藥物開發，致病機制的研究理論提供依據。也可將這些蛋白分子用作候選抗原，研究其免疫保護性，有助于研發有關棘球蚴的有效疫苗。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.005

通訊作者：曹得萍，Email:qhmccdp@163.com

中圖分類號：R383.3

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0021-03

Corresponding author:Cao De-ping, Email: qhmccdp@163.com

收稿日期：2015-03-06；修回日期:2015-09-30

Preliminary protein expression profiling analysis on human hydatid and alveolar hydatid in Qinghai Province

ZHANG Yao-gang,LI Chao-qun,WU De-fang,CAO De-ping

(DepartmentofPathogenicBiology，MedicalCollegeofQinghaiUniversity，Xining810001，China)

Abstract:The aim of this study was to analyze the preliminary protein expression profiling on human Echinococcus granulosus metacestode (protoscoleces, cyst wall and cyst fluid) and Echinococcus multilocularis metacestode. To investigate the profiles at the protein expression level, SDS-PAGE and Western-blot were carried out to detect the protein expressing profiles of human hydatid (protoscoleces, cyst wall and cyst fluid) and alveolar hydatid. Results showed that the protein molecular weight of human hydatid protoscoleces was aggregated in 72 kDa, the protein molecular weight of cyst wall was aggregated in 72 kDa, 26 kDa and 17 kDa, the protein molecular weight of cyst fluid was 72 kDa, 43-55 kDa, 26 kDa and 17 kDa; the protein molecular weight of alveolar hydatid was aggregated in 72 kDa, 55-72 kDa and 26 kDa. Results suggested that the different subspecies may result in different protein expression in human hydatid. And alveolar hydatid also had different protein profile in different subspecies.

Keywords:human hydatid; alveolar hydatid; protein expression profilin

國家自然基金地區項目(No.81360255)和春暉計劃項目(No.2012)聯合資助