中國B.afzelii基因型萊姆病螺旋體GDsh1表面蛋白VlsE保守區段的克隆表達及抗原性分析

劉　煒,張　琳,侯學霞,劉慧鑫,郝　琴,萬康林

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中國B.afzelii基因型萊姆病螺旋體GDsh1表面蛋白VlsE保守區段的克隆表達及抗原性分析

劉煒,張琳,侯學霞,劉慧鑫,郝琴,萬康林

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206

摘要：目的克隆表達中國萊姆病螺旋體B.afzelii基因型菌株GDsh1的表面蛋白VlsE保守區段，并對其抗原性進行分析，為制備中國萊姆病重組抗原ELISA檢測試劑盒提供依據。方法結合文獻，下載并比對PubMed上所有萊姆病螺旋體B.a型菌株的VlsE基因序列，確定保守區段，設計引物，擴增GDsh1 的VlsE基因片段。將擴增產物與載體PET-32a連接，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中表達。對重組載體進行序列測定，表達產物用SDS-PAGE和Western blot 分析。利用重組VlsE蛋白制備ELISA試劑盒，檢測83份萊姆病陽性血清，90份陰性血清以及90份梅毒血清，計算重組試劑盒的靈敏度和特異性。并與科室已有的全菌蛋白ELISA試劑盒檢測結果進行比較。結果成功克隆表達了B.afzelii型VlsE保守區蛋白，Western blot結果顯示VlsE保守區蛋白與免疫兔血清有較強的抗原抗體反應。ELISA結果表明：重組VlsE蛋白的靈敏度60.2%低于全菌蛋白的靈敏度92.8%(P<0.001)；特異性分別為73.3%、68.9%，差異無統計學意義(P=0.511)。在檢測梅毒血清上特異性分別為83.3%、18.9%，重組蛋白的特異性遠遠高于全菌蛋白(P<0.001)。結論重組VlsE基因保守區段蛋白在萊姆病的檢測中具有一定的靈敏度和特異性，且在區分梅毒血清與萊姆病血清上，其特異性遠遠高于全菌蛋白，在萊姆病血清學檢測中具有不容忽視的重要意義。

關鍵詞：萊姆病螺旋體；VlsE蛋白；克隆表達；抗原性分析

Supported by the National Science and Technology Major Project(Nos. 2013ZX10004-001 and 2013ZX10004-101)

萊姆病是一種蜱傳的人獸共患病，其病原體為伯氏疏螺旋體。萊姆病臨床征狀包括：游走性紅斑，面神經麻痹，神經根炎，心臟病，關節炎和慢性萎縮性肢皮炎等，嚴重的導致終身殘疾，甚至死亡[1]。因為萊姆病的臨床癥狀復雜多樣，所以萊姆病的實驗室輔助診斷尤為重要。

目前萊姆病的實驗室診斷主要依靠于血清學診斷方法，包括IFA、ELISA、WB等[2]。用于萊姆病血清學診斷的抗原包括全菌抗原和重組抗原，全菌抗原在檢測萊姆病時敏感度較高，但全菌蛋白在診斷過程中易與梅毒血清、鉤端螺旋體血清有交叉反應，特異性較低[2]。而萊姆病重組蛋白檢測試劑盒可以在一定程度上提高萊姆病檢測的特異性，有很好的應用前景。研究表明用于檢測萊姆病的表面抗原蛋白具有多種，OspA, OspC，鞭毛蛋白，P83/100，P39，VlsE等[3]。其中，國外有研究發現VlsE蛋白在萊姆病血清IgG診斷上有很好的靈敏度和特異性，其保守區段在診斷上亦得到了廣泛的應用[4-6]。由于國內萊姆病螺旋體以B.a(B.afzelii)和B.g(B.garinii)型為主[7]，故而表達這兩個基因型的VlsE保守區段對我國萊姆病的診斷研究具有重要意義。由于VlsE蛋白變異性大，其在不同菌株中的同源性僅有47%～58%[8]，本文探索克隆表達了國內B.a型的VlsE保守區段蛋白，并對其在萊姆病血清上的診斷應用進行評價。

1材料和方法

1.1血清標本83份陽性血清標本來自牡丹江人民醫院，90份陰性血清來自河南油田健康體檢者。90份梅毒血清來自新疆烏魯木齊第一人民醫院梅毒病人。血清的納入排除標準：陽性血清為有蜱叮咬史；具有發熱、紅斑、關節炎等萊姆病癥狀，且IFA檢測陽性(IgG≥1∶128;IgM≥1∶64)；陰性血清來自非萊姆病疫區的健康體檢者，IFA初篩陰性，非梅毒或鉤體病病人；梅毒血清為TPHA試驗陽性，典型梅毒且無萊姆病癥狀患者血清。

1.2萊姆病螺旋體菌株B.a型菌株GDsh1由中國疾病預防控制中心傳染病所萊姆病室提供。

1.3質粒和宿主菌載體PET-32a由中國疾病預防控制中心傳染病所萊姆病室提供。宿主菌BL21(DE3)購于康為世紀生物科技有限公司。

1.4主要試劑Taq DNA聚合酶購于北京六合通生物公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶等購于北京北方儀濤商貿有限公司；96酶標板、TMB顯色液、包被緩沖液等購于北京萊貝斯生物科技有限公司。

1.5B.a型菌株VlsE基因保守區段的確定和引物設計下載并比對PubMed上所有萊姆病螺旋體B.a型菌株的VlsE基因序列，發現有近400 bp的序列，其兩端的堿基序列高度保守，針對兩端保守區段設計引物，并在上下游兩端插入酶切位點。正向引物P1：5′-CGGGGATCCAAGGGGATAAAGGGGATTGTTGA-3′，限制性內切酶位點為BamH I；反向引物 P2：5′-CGGAAGCTTAGCAAACTTTCCATCCTTAGCCA-3′，限制性內切酶位點為Hind III。

1.6VlsE保守區段基因克隆表達及DNA序列測定以GDsh1全基因組為模板，P1-P2為上下游引物，通過PCR擴增得到目的片段，利用PCR產物回收試劑盒回收。同時將PET-32a載體與目的片段用BamH I、Hind III在37 ℃進行雙酶切，并回收酶切產物。T4 DNA連接酶16℃過夜連接酶切后的目的片段及載體。將連接產物轉化至宿主菌BL21(DE3)中。在轉化的平板上挑取陽性菌落，PCR進行驗證，并進行序列測定(由北京擎科新業生物技術有限公司完成)。將陽性克隆接種于LB液體培養基中，待OD600達到0.6時加入誘導劑IPTG(誘導濃度為1 mmol/L)，37 ℃誘導3～5 h。收集菌體進行SDS-PAGE電泳。

1.7蛋白純化大量誘導重組菌后，根據德國Merck公司的His標簽蛋白純化試劑盒對目的蛋白進行純化。 并用Biorad蛋白定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)定量。

1.8免疫印跡(Western blot)以未誘導的重組菌為陰性對照，12%的SDS-PAGE電泳后，通過電轉儀將凝膠上的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，用5%的脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，0.01 mol/L pH7.4 的PBST洗滌3次，將膜轉入1∶25稀釋的免疫兔血清中室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，加入FITC標記的羊抗兔IgG,室溫孵育2 h，洗滌3次，TMB底物顯色液顯色5 min。

1.9酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 利用棋盤滴定的方法，陰陽性血清和重組蛋白分別按1∶50,1∶100,1∶200,1∶400倍和1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320倍稀釋。結合吸光度和P/N值為判斷依據(P/N值=(陽性血清-空白)/(陰性血清-空白))，選擇最適的抗原抗體稀釋倍數。用最適的抗原濃度包被酶標板，分別檢測83份萊姆病陽性血清，90份陰性血清以及90份梅毒血清，同時用科室已有的全菌蛋白包被的ELISA檢測試劑盒檢測這3批血清，并進行重復實驗。兩次實驗結果取均值，利用SPSS19.0軟件制作ROC曲線，判斷重組蛋白的靈敏度與特異性，并比較重組VlsE蛋白與全菌蛋白間的差異。

2結果

2.1重組的VlsE區段在宿主菌BL21(DE3)中的誘導表達以及純化結果重組的VlsE區段蛋白在宿主菌BL21(DE3)中高效、穩定表達。經純化后，獲得了單一的重組VlsE蛋白(見圖1)。

M：蛋白分子量標準; 1.未誘導的重組菌BL21-VlsE; 2.誘導表達的重組菌BL21-VlsE; 3.純化重組蛋白VlsE

2.2重組VlsE蛋白的Western blot分析Western blot結果顯示，重組VlsE蛋白與免疫兔血清發生特異的抗原抗體反應(見圖2)。

M:蛋白分子量標準 1：誘導表達的重組菌BL21-VlsE 2：未誘導的重組菌BL21-VlsE(陰性對照)

M: protein marker; 1: the expressed recombinant protein in BL21-VlsE; 2: the unexpressed recombinant protein in BL21-VlsE(Negative control).

圖2重組蛋白VlsE與免疫兔血清WB分析

Fig.2Western blot analysis of recombiant protein with immune rabbit serum

2.3B.a型菌株GDsh1 VlsE保守區段序列采用BLAST與B.a型歐洲標準菌株PKo的VlsE蛋白保守段序列同源性95%，測序結果如下:

2.4ELISA檢測結果

2.4.1重組蛋白最佳包被濃度及血清最佳稀釋度的確定據原始吸光度結果以及棋盤滴定的結果確定的最佳抗原稀釋度為1∶160，最佳血清稀釋度為1∶50。重組蛋白定量結果為355 μg/mL，故而最佳抗原包被濃度為2.2 μg/mL。

2.4.2重組蛋白與全菌蛋白ELISA檢測83份陽性血清以及90份陰性血清的吸光度值，利用SPSS19.0制作ROC曲線，以youden指數(youden指數=敏感度-(1-特異度))值最大對應的吸光度值作為cutoff值(ROC曲線見圖3)。以cutoff值為界值，得到重組VlsE蛋白在萊姆病血清、陰性血清、梅毒血清中陽性數分別為50、24、15，全菌蛋白陽性數分別為77、28、73(見表1)。利用卡方檢驗對重組VlsE蛋白與全菌蛋白在萊姆病血清、陰性血清、梅毒血清檢測上的差異進行比較，得到χ2值分別為24.432(P<0.001)、0.433(P=0.511)、74.792(P<0.001)，由此可見重組VlsE蛋白靈敏度低于全菌蛋白，其特異性與全菌蛋白無統計學差異，但在梅毒血清檢測上重組VlsE蛋白特異度遠遠高于全菌蛋白。

表1　重組VlsE蛋白與全菌蛋白ELISA檢測結果

圖3　重組蛋白VlsE和全菌蛋白ROC曲線

3討論

萊姆病診斷的金標準依舊是病原體培養[9]，但是其低檢出率并不適用于臨床診斷。目前萊姆病的臨床診斷主要根據流行病學史、臨床表現以及實驗室檢測結果來確診。近年來不乏有學者報道利用重組蛋白在萊姆病血清ELISA試驗診斷中的重要意義。OspC, Fla, P39，DbpA,P83等重組蛋白已被用于萊姆病的ELISA試驗中。早在1999年有學者發現，Borreliaburgdorferi型菌株B31的VlsE蛋白在萊姆病血清IgG的檢測中有較高的敏感度和特異性，其保守的IR6肽段在區分梅毒血清與萊姆病血清中，90%的特異性遠遠大于全菌蛋白在梅毒血清中的特異性20%[10-11]。但由于VlsE蛋白在不同基因型不同株的萊姆病螺旋體中變異較大，基因同源性僅有60%左右[8]，且并非所有菌株均含有VlsE基因，故而表達一個基因型一株菌的VlsE蛋白在檢測診斷中具有一定的偏倚性。Msria J等研究比較了Borreliaburgdorferi型菌株B31和Borreliagarinii型菌株IP90合成的IR6肽在萊姆病血清ELISA檢測中的作用，結果顯示不同基因型的IR6肽在區分萊姆病血清和梅毒血清的特異性有所不同。且不同型的IR6肽在靈敏度和特異性上與血清的地區來源有正相關性[12]。

由于國內萊姆病螺旋體主要以B.g，B.a型為主[6]，本次研究以B.a型菌株為研究對象，通過PubMed上已有的B.a型菌株的VlsE基因序列的對比分析，發現了一段近400 bp兩端高度保守的基因序列，并對此保守區進行了克隆表達，獲得了高效、穩定表達的重組VlsE蛋白， WB結果顯示重組VlsE蛋白具有較好的抗原性。重組VlsE蛋白在萊姆病血清ELISA檢測中，其敏感度和特異性與全菌蛋白比較均無明顯優勢，可能與VlsE基因在病人所感染菌株中是否表達或全菌各蛋白間的相互作用有關。但值得重視的是，全菌蛋白在診斷萊姆病血清時，易與梅毒病人血清產生交叉反應，90份梅毒血清中，全菌蛋白診斷陽性率(81.1%)遠遠高于重組蛋白(16.7%)，可見重組VlsE蛋白在區分萊姆病血清和梅毒血清中具有重要作用，可以作為萊姆病重組試劑盒的抗原成分之一。

參考文獻：

[1]Stanek G, Wormser G P, Gray J, et al. Lyme borreliosis[J].The Lancet, 2012, 379(9814): 461-473. DOI: 10.1016/S0140-6736(11)60103-7

[2]Wang YJ, Shi LM, Bao FK, et al. The research progress of Lyme disease diagnostic technology[J].Bull Sci Technol, 2013, 29(5): 37-46.(in Chinese)

汪玉嬌,史立敏,寶福凱,等.萊姆病診斷技術研究進展[J].科技通報,2013,29(5): 37-46.

[3]Niu QL,Yin H, Luo JX. The research progress of Lyme disease in China[J].Progr Vet Med, 2009, 30(10): 89-93.(in Chinese)

牛慶麗,殷宏,羅建勛.國內萊姆病研究進展[J].動物醫學進展,2009,30(10): 89-93.

[4]Stanek G, Lusa L, Ogrinc K, et al. Intrathecally produced IgG and IgM antibodies to recombinant VlsE, VlsE peptide, recombinant OspC and whole cell extracts in the diagnosis of Lyme neuroborreliosis[J].Med Microbiol Immunol, 2014, 203(2): 125-132. DOI: 10.1007/s00430-013-0322-1

[5]Porwancher RB, Hagerty CG, Fan J, et al. Multiplex immunoassay for Lyme disease using VlsE1-IgG and pepC10-IgM antibodies: improving test performance through bioinformatics[J].Clin Vaccine Immunol, 2011, 18(5): 851-859. DOI: 10.1128/CVI.00409-10

[6]Van Burgel ND, Brandenburg A, Gerritsen HJ, et al. High sensitivity and specificity of the C6-peptide ELISA on cerebrospinal fluid in Lyme neuroborreliosis patients[J].Clin Microbiol Infect, 2011, 17(10): 1495-1500. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2011.03459.x

[7]Hao Q, Hou X, Geng Z, et al. Distribution ofBorreliaburgdorferisensu lato in China[J].J Clin Microbiol, 2011, 49(2): 647-650. DOI: 10.1128/JCM.00725-10

[8]Gottner G, Schulte-Spechtel U, Wilske B. Heterogeneity of the immunodominant surface protein VlsE among the three genospecies ofBorreliaburgdorferipathogenic for humans[J].Int J Med Microbiol Suppl, 2004, 293: 172-173.

[9]Marques AR. Laboratory diagnosis of Lyme disease: advances and challenges[J].Infect Dis Clin North Am, 2015, 29(2): 295-307. DOI: 10.1016/j.idc.2015.02.005

[10]Liang FT, Steere AC, Marques AR, et al. Sensitive and specific serodiagnosis of Lyme disease by enzyme-linked immunosorbent assay with a peptide based on an immunodominant conserved region ofBorreliaburgdorferiVlsE[J].J Clin Microbiol, 1999, 37(12): 3990-3996.

[11]Lawrenz MB, Hardham JM, Owens RT, et al. Human antibody responses to VlsE antigenic variation protein ofBorreliaburdorferi[J]. J Clin Microbiol, 1999, 37(12): 3997-4004.

[12]Gomes-Solecki MCJ, Meirelles L, Glass J, et al. Epitope length, genospecies dependency, and serum panel effect in the IR6 enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibody toBorreliaburdorferi[J].Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(7): 875-879.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.003

通訊作者：萬康林，Email: wankanglin@icdc.cn；

中圖分類號：R377

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0013-04

Corresponding authors: Wan Kang-lin, Email: wankanglin@icdc.cn; Hao Qin, Email: haoqin@icdc.cn

收稿日期：2015-07-22；修回日期:2015-10-20

Cloning and expressing a conserved region of surface protein VlsE gene from a Chinese Borrelia afzelii strain GDsh1 and analyzing antigenicity of rVlsE protein

LIU Wei,ZHANG Lin,HOU Xue-xia,LIU Hui-xin,HAO Qin,WAN Kang-lin

(StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasesPreventionandControl,CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDiseases,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

Abstract:We cloned and expressed a conserved region of surface protein VlsE gene from a Chinese Borrelia afzelii strain GDsh1, and analyzed the antigenicity of the rVlsE protein to support the development of Chinese ELISA recombinant antigen detection kit for Lyme disease. According to literature, we downloaded and aligned VlsE sequences of all B. afzelii strains from PubMed to identify conserved segment and design primers. The target fragment was amplified and inserted into an expression vector PET-32a and expressed in E. coli B21. The expressed protein was identified by SDS-PAGE, western blot and gene sequence. ELISA was performed with the rVlsE protein to test 83 Lyme disease sera, 90 negative serum samples and 90 samples of syphilis serum, thereby to determine the sensitivity and specificity of the rVlsE protein. SDS-PAGE analysis showed the conserved region was successful expressed in E. coli. Western blot results confirmed that recombinant protein was able to response with immune rabbit serum. ELISA results showed that the sensitivity of rVlsE protein and the whole borrelia burgdorferi protein were 60.2% and 92.8%(P<0.001), the specificity were 73.3% and 68.9%(P=0.511). The specificity of this method in the detection of syphilis serum was 83.3%, much higher than that using the whole bacterial protein(18.9% specificity)(P<0.001). The method using conserved fragments of VlsE protein has certain sensitivity and specificity in the distinguishing of syphilis and Lyme serum samples, its specificity is much higher than the whole cell protein. Therefore, the conserved fragments of VlsE in Lyme disease serological detection should not be ignored.

Keywords:Borrelia burgdorferi; VlsE protein; gene expressing; antigenic analysis

國家科技重大專項(No.2013ZX10004-001，No. 2013ZX10004-101)

郝琴，Email: haoqin@icdc.cn