枸杞多糖提取工藝的優(yōu)化

王赟夷，李龍飛，胡 彪，彭 芳（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

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枸杞多糖提取工藝的優(yōu)化

王赟夷，李龍飛，胡 彪，彭 芳
（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

摘 要：通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)影響枸杞多糖提取率的因素提取時(shí)間、提取溫度和固液比進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：各因素按影響程度大小排序?yàn)楣桃罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。枸杞多糖提取工藝最佳提取方案：固液比為1︰30，提取溫度為75℃，提取時(shí)間為3.0 h，在該工藝下多糖最高提取率為1.14%。

關(guān)鍵詞：枸杞多糖；提取工藝；優(yōu)化

枸杞子為茄科植物枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果實(shí)，具有堅(jiān)筋骨、補(bǔ)精氣、諸不足、明目安神、令人長(zhǎng)壽等功效，是我國(guó)傳統(tǒng)的滋補(bǔ)中藥材［1］。枸杞多糖（LBP，Lycium Barbarum Polysaccharides）是由多個(gè)單糖或衍生物聚合而成的大分子活性化合物，是枸杞生物學(xué)作用的主要有效成分之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖組成。枸杞多糖對(duì)機(jī)體有非特異性免疫調(diào)節(jié)功能，可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞突變［2-6］，延緩衰老，并具有抗疲勞、降血脂、降血糖、抗脂肪肝等功效［7-10］，已成為保健食品中一種重要的功能性添加劑，有著廣闊的應(yīng)用前景。鑒于LBP的多種藥理作用和生理功能，參考前人多糖提取方法［11-13］，研究采用DNS比色法測(cè)定枸杞多糖濃度，對(duì)枸杞多糖提取的影響因素進(jìn)行了單因素和正交試驗(yàn)，優(yōu)選出最佳的枸杞多糖提取工藝參數(shù)，以期為枸杞子多糖新藥物功能及其保健食品的開發(fā)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試枸杞子從市場(chǎng)購(gòu)得。試驗(yàn)主要試劑有蒸餾水、DNS顯色液、95%乙醇、正丁醇、氯仿、分析純葡萄糖等。

試驗(yàn)主要儀器有數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6（國(guó)華電器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），漩渦振蕩儀，KQ2200V超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），榨汁機(jī)，高速（冷凍）離心機(jī)，紫外分光光度計(jì)（美國(guó)PE公司），恒溫鼓風(fēng)干燥箱，電子秤和燒杯等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器材。

1.2 枸杞多糖的提取工藝優(yōu)化

1.2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) （1）固液比。稱取10.0 g烘干并粉碎的枸杞子樣品，分別配制固液比為1︰25、1︰30、1︰35的提取液，在80 ℃恒溫提取3.5 h。（2）提取溫度。稱取10.0 g烘干并粉碎的枸杞子樣品，固液比1︰30，分別在75、80和85℃下恒溫提取3.5 h。（3）稱取10.0 g烘干并粉碎的枸杞子樣品，固液比1︰30，在80 ℃恒溫條件下分別提取3.0、3.5、4.0 h。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以固液比、提取溫度、提取時(shí)間為因素進(jìn)行（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)的因素水平如表1所示。

1.2.3 枸杞多糖的獲得 將提取后的混合物抽濾得上清液，由旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，加入適量95%乙醇在高速離心機(jī)中以8 000 r/min離心20 min，倒去上清液得到沉淀，沉淀經(jīng)干燥后得到粗多糖。取枸杞粗多糖以適量水溶解，加入等體積的氯仿和正丁醇混合溶液（4︰1），搖勻后，在高速離心機(jī)中以8 000 r/min離心20 min，除去蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，如此反復(fù)操作，直至不再出現(xiàn)白色的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，多糖溶液濃縮至一定體積冷凍干燥后，即得枸杞多糖。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.3 枸杞多糖的測(cè)定

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7支15 mL的試管，分別添加0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL），不足1.0 mL的用蒸餾水補(bǔ)足，每支試管加入2 mL DNS試劑，搖勻，在沸水浴加熱2 min，冷卻后用蒸餾水補(bǔ)足到15 mL刻度。在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 枸杞多糖待測(cè)液的制備 精確稱取干燥后的多糖50 mg，置于研缽中，加三蒸水研磨，將溶液倒入50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，精確吸取該溶液5 mL于50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，取稀釋后的多糖溶液1.0 mL于15 mL刻度試管中，加2.0 mL DNS試劑，沸水煮沸2 min，冷卻后用水補(bǔ)足到15 mL刻度，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，吸光度值A(chǔ)（y）與葡糖糖含量（x）的關(guān)系為y=11.395x-0.016 3，R2=0.998 2。

圖1 葡萄糖含量與吸光度值的關(guān)系

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 固液比對(duì)枸杞多糖提取率的影響 由圖2可知，當(dāng)固液比為1︰30時(shí)，提取率最大。因此，試驗(yàn)初步選定固液比為1︰30。

圖2 固液比對(duì)枸杞多糖提取率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響 從圖3中可以看出，隨著提取溫度的升高，枸杞粗多糖的提取率逐漸升高，在溫度為80℃時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著溫度的升高，提取率開始下降。因此，試驗(yàn)初步選定提取溫度為80℃。

圖3 溫度對(duì)枸杞多糖提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響 由圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖提取率呈增加趨勢(shì)，在3.5 h時(shí)達(dá)到最大，然后開始降低。因此，初步選定提取時(shí)間為3.5 h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

從表2正交試驗(yàn)的直觀分析結(jié)果可知，各因素按影響程度大小排序?yàn)楣桃罕龋咎崛囟龋咎崛r(shí)間。提取枸杞多糖的最佳工藝為A2B2C2，即固液比1︰30，提取溫度為80℃，提取時(shí)間3.5 h，此條件下枸杞多糖提取率最高。但正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，提取溫度和提取時(shí)間對(duì)枸杞多糖提取率的影響并不顯著（P＞0.05），所以在方差分析的基礎(chǔ)上可以選擇溫度最低、提取時(shí)間最短的水平，則最優(yōu)方案為A2B1C1。即固液比為1︰30，提取溫度為75℃，提取時(shí)間為3 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 最優(yōu)方案的驗(yàn)證

以最優(yōu)方案進(jìn)行枸杞多糖的提取，經(jīng)過5次重復(fù)試驗(yàn)，枸杞多糖的提取率最高可達(dá)1.14%，但最低提取率只有0.58%。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，枸杞多糖提取的最優(yōu)工藝參數(shù)為：固液比1︰30，提取溫度75℃，提取時(shí)間3 h，最佳提取率為1.14%。此次試驗(yàn)枸杞多糖的提取率都不高，最優(yōu)方案重復(fù)所得結(jié)果也存在一定差異。枸杞多糖是以糖肽復(fù)合物為主，在用高濃度的乙醇醇析、脫脂的過程中，很容易造成糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)的不可逆變，存在一定的耗損，這可能是造成提取率不高的原因。

研究采用傳統(tǒng)的熱水浸提法對(duì)枸杞多糖進(jìn)行提取，該法所得多糖提取液可直接離心除去不溶物，利用多糖不溶于高濃度乙醇的性質(zhì)，用高濃度乙醇醇析，脫脂，再用氯仿-正丁醇脫蛋白，然后用水提取濃縮，真空干燥后得到多糖粗品。此方法提取設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、易操作，但耗能多，操作時(shí)間長(zhǎng)。阿依姑麗·艾合麥提［14］的研究表明，超聲法提取枸杞多糖具有提取率高、操作時(shí)間短，有效成分破壞少等特點(diǎn)，因?yàn)槌暡軌蚱扑橹参锏募?xì)胞壁，從而可大幅度提高有效成分的提取率，極大縮短了提取時(shí)間。

常見的多糖測(cè)定方法有苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，但這兩種方法測(cè)定步驟繁瑣，而且只能測(cè)定樣品中總糖的含量，如果待測(cè)樣品中含有單糖成分，則會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高；而且由于硫酸具有嚴(yán)重的腐蝕性，苯酚極易氧化，給實(shí)驗(yàn)操作帶來極大不便。該研究采用的DNS法具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、雜質(zhì)干擾較小等優(yōu)點(diǎn)，近年來逐漸被應(yīng)用于植物藥、中成藥、海洋生物藥等多糖含量的測(cè)定［12-13］。

在今后的研究中，對(duì)不同植物多糖的提取，應(yīng)當(dāng)根據(jù)目標(biāo)多糖的特點(diǎn)、理化性質(zhì)，進(jìn)行綜合比較，選取最佳方法和提取工藝。

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（責(zé)任編輯：成 平）

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-060X（2016）06-0071-03

DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.06.023

收稿日期：2016-04-11

作者簡(jiǎn)介：王赟夷（1992-），男，湖北襄陽市人，本科生，生物技術(shù)專業(yè)。

通訊作者：彭 芳

Extraction Process Optimization of Lycium barbarum Polysaccharides

WANG Yun-yi，LI Long-fei，HU Biao，PENG Fang
（School of Biology and Pharmaceutical Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， PRC）

Abstract:In order to study solid-liquid ratio， extraction temperature， extraction time， the impact of Lycium barbarum polysaccharide extraction rate， the treatment conditions were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment design. The results showed that the main factors infuencing the extraction rate of extraction were solid liquid ratio＞ extraction temperature ＞extraction time. The optimum technological conditions for extract polysaccharides from Lycium barbarum were as follows: the material liquid ratio of 1:30， the temperature of 75℃， the extraction time of 3 h. Under the optimal conditions， the highest yield of polysaccharides reached 1.14%.

Key words:Lycium barbarum polysaccharides； extraction； optimization