扶正消癌Ⅰ號方對小鼠腸癌肝轉移血管內皮生長因子的表達的影響

張艷麗　張紅衛　杜　鵑　侯安繼,3

(1 上海市第七人民醫院腫瘤科，上海，200137； 2 第二軍醫大學附屬長海醫院中心實驗室，上海，200137；3 上海市徐匯區中心醫院腫瘤科，上海，200137)

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扶正消癌Ⅰ號方對小鼠腸癌肝轉移血管內皮生長因子的表達的影響

張艷麗1張紅衛1杜鵑2侯安繼1,3

(1 上海市第七人民醫院腫瘤科，上海，200137； 2 第二軍醫大學附屬長海醫院中心實驗室，上海，200137；3 上海市徐匯區中心醫院腫瘤科，上海，200137)

摘要目的：觀察自擬扶正消癌Ⅰ號方對balbc小鼠移植瘤血管內皮生長因子(VEGF)表達的作用，探討該方對多種腫瘤的作用機制。方法：采用balbc小鼠，脾下注射法建立鼠大腸癌細胞株肝轉移的動物模型，隨機分為4組，每組12只：1)陰性對照生理鹽水組；2)氟尿嘧啶組；3)扶正消癌I號方中藥組；4)扶正消癌I號中藥+氟尿嘧啶組。觀察生活質量，抑瘤率，免疫組化方法檢測VEGF蛋白表達的情況。結果：扶正消癌I號方+氟尿嘧啶組、消癌I方組小鼠的生活質量較其他2組好，陰性對照組瘤體最大，瘤體中藥組其次，聯合用藥組體積最小，氟尿嘧啶組、中藥組及聯合用藥組均能下調VEGF蛋白的表達。結論：扶正消癌Ⅰ號方對鼠大腸癌細胞株肝轉移小鼠抑制新生血管的作用機制可能是通過下調VEGF的表達，抑制腫瘤微血管生成，可能是該方抗腫瘤的機制之一。

關鍵詞中醫藥；血管生成；血管內皮生長因子

隨著人類飲食生活水平的提高和生活水平的改變，結直腸癌的發病率逐年增加，給社會帶來了巨大的負擔。大腸癌其5年生存率仍不高，主要原因是腫瘤的轉移和復發，近些年來腫瘤新生血管生成是研究熱點，實體腫瘤的生長、侵襲和轉移都依賴于腫瘤血管的生成。以益氣扶正[1]為根本大法是大腸癌防治中最常用的治療手段之一，氟尿嘧啶以抗代謝物而起作用，干擾DNA、RNA合成而組織腫瘤細胞的合成。本研究利用鼠大腸癌細胞株肝轉移的Bablc小鼠模型，探討扶正消癌I號聯合氟尿嘧啶對荷瘤小鼠血管生長的抑制作用與機制。

1材料

1.1實驗動物清潔級Balb/c小鼠48只，雌雄各半，體質量(20+2)g，由第二軍醫大學，長海醫院實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0003，實驗動物使用許可證號SYXK(滬)2007-0003。分籠飼養，適應環境3 d后開始實驗。

1.2實驗藥物扶正消癌I號方(由上海市第七人民醫院中藥房提供，每毫升含生藥2.8 g，相當于人用量的5倍)，密封，4 ℃保存，臨用前配置。氟尿嘧啶(5-Fu)(上海旭東海普藥業有限公司生產，生產批號：FA140418，規格：10 mL∶0.25 g)。小鼠大腸癌細胞株CT26.WT細胞，ATCC公司提供。RPMI1640，Sigma提供，小牛血清，杭州四季青公司提供。EnVision試劑(HRP/Rabbit and mouse)(貨號：K500711 kit，丹麥Dako)

2實驗方法

2.1造模方法本研究參考國內外文獻，用脾臟注射法建立小鼠大腸癌細胞株(CT26)肝轉移模型[2]。常規培養小鼠大腸癌細胞株CT26，接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養基，置于37 ℃、50 mL/L CO2恒溫箱中培養。于對數生長期細胞，用生理鹽水，制成5×107細胞/mL濃度的細胞懸液，取50 L接種于4～6周齡雌性Balb/c小鼠脾被膜下。在注射部位可見脾被膜發白、腫脹，拔出針頭，立即止血按壓，約3 min，觀察無出血后，把脾臟送回腹腔內，關腹。嚴格無菌操作。術后繼續在SPF條件下飼養。

2.2分組與給藥方案

2.2.1分組當小鼠肝臟部位出現約0.5 cm直徑大小瘤體時編號，采用數字表法隨機分為4組，即扶正消癌I號中藥方(簡稱消癌I方)+氟尿嘧啶組、消癌I方組、氟尿嘧啶及陰性對照生理鹽水組，每組12只均置于SPF環境下飼養。

2.2.2給藥方案1)陰性對照生理鹽水組：生理鹽水，1.5 mL/只，1次/d，灌胃，連續給藥2周；2)氟尿嘧啶組(20 mg/kg)，1.5 mL/只，每隔2 d給藥1次，腹腔注射，連續給藥2周；3)扶正消癌I號方中藥組，中藥方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃，連續給藥2周；4)扶正消癌I號中藥+氟尿嘧啶組：中藥方(36 g/kg)，1.5 mL/d，1次/d，灌胃；氟尿嘧啶(20 mg/kg)，每隔2 d給藥1次，腹腔注射，連續給藥2周。上述治療組均于隨機分組當日起給藥；飼料、飲水自由。

2.3標本提取第15天處死。嚴格無菌操作取瘤重W，清除部分壞死和纖維結締組織，取一小塊組織管，-80 ℃液氮冷凍保存，10%中性福爾馬林溶液固定、石蠟包埋的殘留組織，連續4 mm切片，免疫組化檢測。每組2例。免疫組化法檢測血管內皮生長因子的表達。瀕死小鼠及時處死解剖，瘤組織切取和保存方法同前。

2.4檢測指標

2.4.1觀察小鼠每天的飲食、水，體重，活動度，毛發光澤度及精神狀況。

2.4.2瘤重、抑瘤率建模治療后，觀察抗腫瘤效果，每隔3 d用游標卡尺測量腫瘤最大直徑和橫向尺寸的估計量，平均各組，繪制生長曲線：1/2(直徑×寬度)。第15天稱重，脫頸處死小鼠，并在無菌操作下取出腫瘤組織，并迅速稱重W。每組2例肝腫瘤。計算實體腫瘤生長抑制率(IR)：IR(%)=(1一治療組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100%。

2.4.3免疫組化法檢測VEGF蛋白表達采用Envision免疫組化染色法。在普通顯微鏡下觀察并攝片。操作步驟參照說明書：每個腫瘤組織切片常規脫蠟，在高溫檸檬酸抗原修復后，加3%過氧化氫，用PBS洗滌，滴VEGF抗體1∶100(50 μL/組織塊)，4 ℃過夜，用PBS洗滌，二抗37 ℃孵育，DAB顯色，復染，脫水，封片。陽性細胞細胞質呈棕黃色顆粒。參考劉曼曼等檢測方法[3]，先在低倍鏡下(100)，陽性染色最密集的區域，然后在400次從5個隨機選擇的視覺范圍，輸入的顯微圖像分析系統(leica QV3系統)，染色強度的變化的陽性細胞作為定量指標，計算平均灰度值的陽性表達水平，灰度值越小，陽性表達水平愈高，反之亦然。

3結果

3.1一般情況各組小鼠用藥期間活動性表現差異明顯。在整個過程中，氟尿嘧啶組有小鼠因一般情況較差，有2只未完成實驗。其中生理鹽水組小鼠瘤體增長最大，進食量明顯減少，小鼠精神狀態較差，活動度減少，隨時間延長，其明顯消瘦，消癌I方組小鼠雖然瘤體大，但是攝食、飲水量、精神狀態較其他組明顯好。消癌I方組、氟尿嘧啶組、聯合用藥組體重較生理鹽水組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而各用藥組體重差異無統計學意義。

3.2瘤重、抑瘤率初期各組小鼠腫瘤體積均隨著時間推移呈現增長趨勢，陰性對照組>消癌I方組>氟尿嘧啶組>聯合用藥組(見表1)。用藥組中，聯合用藥組小鼠的瘤體生長速度較其他組慢，單純中藥組、中藥和氟尿嘧啶聯合用藥組其瘤體生長速度最快，但小鼠生活精神狀態較其他用藥組改善，隨著時間延長，氟尿嘧啶組和聯合用藥組均出現縮小趨勢，但均未出現腫瘤消失情況。抑瘤率分別為中藥組59.83%，氟尿嘧啶組73.68%，聯合用藥組84.48%(見表2)。各用藥組與對照組瘤體治療差異均有統計學意義(P<0.01)。

表1　各組小鼠種植瘤的生長情況

表2　各組藥物對小鼠移植瘤的抑制作用

注：與陰性對照組比較：**P<0.01。

表3　各組對腸癌CT26細胞小鼠移植瘤VEGF的蛋白表達水平的影響±s)

注：與陰性對照組比較：**P<0.01，*P<0.05。

圖1　免疫組化檢測荷瘤組織中VEGF表達

注：A:生理鹽水陰性對照組，光學顯微鏡(×40)；B：消癌I方組，光學顯微鏡(×40)；C：氟尿嘧啶組，光學顯微鏡(×40)；D：中藥+氟尿嘧啶組，光學顯微鏡(×40)。

3.3對VEGF蛋白表達的影響陽性細胞細胞質呈棕黃色顆粒。本實驗的結果表明，與生理鹽水陰性組比較，聯合用藥組、消癌I方組、氟尿嘧啶組治療均可降低VEGF蛋白的表達，差異均有統計學意義(P<0.01)，與氟尿嘧啶組比較，雖然中藥組VEGF表達無統計學意義(P>0.05),但有減少的趨勢。統計分析表明，消癌I方組單獨或聯合氟尿嘧啶，均可顯著抑制荷瘤瘤體VEGF的表達。(見表3，圖1)

4討論

現代醫學研究表明，在1971年，Folkman等[4]人首次發現腫瘤的生長依賴于腫瘤組織的血管生成。如果沒有營養支持，腫瘤不能超過1～2 mm3。新生血管是腫瘤生長和轉移的必備條件，血管內皮細胞具有低突變性、穩定遺傳性，抗血管生成、抑制血管內皮生長因子直接針對腫瘤血管內皮細胞。許多惡性腫瘤細胞VEGF的自分泌作用，促進局部血管的形成。血管內皮生長因子是最重要的促血管生成因子，直接促進內皮細胞的增殖，促進新生血管的形成[4-5]。結直腸癌患者血清中，VEGF、MVD與預后相關，可作為檢測大腸癌預后的參考指標[6]。近年來，血管內皮生長因子是抗血管生成治療的重要靶點，已成為一個熱門話題，從而引起科學家們的關注[7]。貝伐單抗(BEV)通過直接阻斷VEGF抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤血管的生長[9-10]。但目前大多數文獻通過臨床組織標本和體外實驗細胞的檢測，探討與腫瘤血管生成的關系，中藥復方[11-14]以健脾補氣行氣、活血化瘀法見多。針對目前很多不能耐受化療的患者，中醫學在這方便發揮了極大的優勢。我們從臨床觀察中腫瘤晚期患者服用補氣活血化瘀中藥后[15-17]能明顯提高其近期療效和改善生活質量。扶正抗癌I號方是上海市第七人民醫院腫瘤科治療腸癌的長期經驗總結，全方組成黃芪15 g，太子參15 g，茯苓10 g，白術10 g，山藥10 g，白花蛇舌草30 g，藤梨根15 g，山慈菇15 g，蜈蚣2條等組成，處方中以扶正益氣之黃芪、太子參、茯苓、白術等為君，攻伐抗癌之白花蛇舌草、山慈菇等為臣，佐以藤梨根、蜈蚣等，使以甘草，全方共奏扶正抗癌之效。前期臨床觀察中能明顯改善晚期腫瘤患者的生活質量[18-19]，我們的實驗結果發現，消癌I方組、氟尿嘧啶組、聯合瘤體均有減小，各用藥組中，中藥組瘤體質量最大，但生活質量較氟尿嘧啶組一般情況好，說明扶正益氣為主的重要能對改善生活質量起到一定作用。聯合用藥組、消癌I方組、氟尿嘧啶組治療均可降低VEGF蛋白的表達，差異均有統計學意義(P<0.01)，與氟尿嘧啶組比較，雖然單純消癌I方中藥組VEGF表達無統計學意義(P>0.05)，但有減少的趨勢。扶正消癌I號方、氟尿嘧啶及聯合用藥均可明顯抑制大腸癌細胞株CT26移植瘤的生長，因此，我們認為，消癌I號聯合氟尿嘧啶在荷瘤鼠體內均具有抗血管生成作用。消癌I號方抗血管生成可能是通過下調VEGF的表達間接抑制腫瘤血管形成，直接作用于血管內皮細胞，抑制腫瘤組織生長。

參考文獻

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(2015-07-12收稿責任編輯：張文婷)

Effect of Fuzheng Xiaoai I Decoction on the Expression of VEGF in the Liver Metastasis of Colon Cancer Mice

Zhang Yanli1, Zhang Hongwei1, Du Juan2, Hou Anji1,3

(1OncologyDepartmentoftheSeventhPeople'sHospitalofShanghai,Shanghai200137,China; 2CenterLaboratoryofChanghaiHospitalaffiliatedtoSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200137,China;3OncologyDepartmentofCenterHospitalofXuhuiDistrict,Shanghai200137,China)

AbstractObjective:To investigate the effect of Fuzheng Xiaoai I decoction on VEGF expression of mice with liver metastasis of colon cancer, and discuss its possible mechanism.Methods:The tumor models were established by injecting human carcinoma of CT26 cells under the balbc mice. Balbc mice with liver cancer cells are randomized divided into 4 groups (12 in each group): 1)Control group; 2)5-Fu group; 3)Fuzheng Xiaoai I group; 4)Fuzheng xiaoai I+5-Fu group. The life quality of mice, tumor inhibiting rates, and the expression of VEGF in tumor tissue were measured.Results:The life quality of group 4 and 3 are better than that of the other groups. Besides, the tumor size of group 4 was the smallest, and that of the control group was the biggest. The levels of VEGF in all groups were decreased.Conclusion:Fuzheng Xiaoai I could inhibit the angiogenesis of tumor possibly by down regulating VEGF and obstructing the formation of tumor vessels.

Key WordsTraditional Chinese medicine; Angiogenesis; VEGF

基金項目：上海市衛生局中醫藥科研基金項目(編號：2012QJ006B)，上海市浦東新區衛生系統重點學科群建設項目(編號：PWZxq2014-12)，上海市第七人民醫院“七院新星”培養計劃(編號：qyxx-2012-26)

作者簡介：張艷麗(1983.04—)，女，碩士研究生，主治醫師，研究方向：中西醫結合腫瘤防治，Tel：(021)58670561-6340，E-mail：yanly_zhang@163.com 通信作者：侯安繼(1964.12—)，男，博士研究生，主任醫師，碩士研究生導師，研究方向：中西醫結合消化道腫瘤臨床和實驗研究，Tel：(021)58670561-6337，E-mail：anjihou@163.com

中圖分類號：R289.5

文獻標識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.035