雪蓮十味片總黃酮提取工藝研究

蘇　苗　紅　梅　阿拉騰敖日格勒　包勒朝魯

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院，呼和浩特，010110)

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雪蓮十味片總黃酮提取工藝研究

蘇苗紅梅阿拉騰敖日格勒包勒朝魯

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥研究院，呼和浩特，010110)

摘要目的：研究雪蓮十味片總黃酮的超聲提取工藝。方法：以總黃酮含量為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)篩選出雪蓮十味片提取總黃酮最佳路線，以蘆丁為對照品，紫外可見分光光度法測定復(fù)方片總黃酮的含量。結(jié)果：雪蓮十味片總黃酮提取最佳方法為75%的乙醇溶液，在55 ℃下，超聲提取50 min。平均提取量12.27 mg/g。結(jié)論：優(yōu)選出的最佳工藝簡單易行，能夠大大提高雪蓮十味片的總黃酮提取率。

關(guān)鍵詞雪蓮十味片；總黃酮；正交實(shí)驗(yàn)；紫外分光光度法

雪蓮十味片為蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗(yàn)方，由苞葉雪蓮花、甘青烏頭、紅花等10味藥組成，具有清瘟解熱、止痛之功效，主要用于疼痛性亞甲炎、扁桃體炎、上呼吸道感染等。本研究旨在測定復(fù)方中主要活性成分總黃酮的含量，實(shí)驗(yàn)以黃酮類化合物為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化雪蓮十味片中總黃酮提取方法，并進(jìn)行了含量測定。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器設(shè)備TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；JA5003N型電子分析天平(上海菁海儀器有限公司)；HH-S8電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；DFT-200萬能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；KQ250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.1.2藥材雪蓮十味片：從市場購置苞葉雪蓮、紅花、甘青烏頭等10味藥材，經(jīng)蒙醫(yī)藥研究院那生桑教授鑒定均為真品后，粉碎過30目篩，按處方比例進(jìn)行混合制粒，壓片即可。

1.1.3試劑蘆丁對照品(BR含量≥98%，購于中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707)；石油醚(天津永晟精細(xì)化工有限公司，批號：20130125)；乙醇(天津市化學(xué)試劑三廠，批號：20130120)；亞硝酸鈉(天津市盛富江化工銷售有限公司，批號：20050405)；氫氧化鈉(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號：20101020)；硝酸鋁(天津市博迪化工有限公司，批號：20050518)等。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品20.75 mg，置于100 mL容量瓶中，用75%乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻,得濃度為0.207 5 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用。

1.2.2供試品溶液的制備精密稱取樣品約1.05 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL石油醚，加熱回流1 h。棄去石油醚，揮干溶劑，加入10倍量75%乙醇溶液，超聲提取30 min[1-2]，冷卻，抽濾，棄去藥渣，濾液置于50 mL容量瓶中，加入75%乙醇溶液將其定容，并作為樣品溶液備用。

1.2.3測定波長的選擇分別吸取對照品溶液、供試品溶液各2 mL，置于25 mL的容量瓶中。各加75%乙醇至7 mL、5%NaNO2溶液1 mL后放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻靜置6 min,加4%的NaOH溶液10 mL,最后用75%乙醇溶液定容至刻度，密塞，搖勻放置15 min[3]，用紫外可見分光光度法，掃描圖譜(200～800 nm)，在510 nm處有較強(qiáng)吸收。因此選擇510 nm作為測定波長。

1.2.4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]精密吸取上述配置對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加75%乙醇至7 mL 5%NaNO2溶液1 mL,放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1 mL,搖勻靜置6 min,加4%的NaOH溶液10 mL,最后用75%乙醇溶液定容至刻度，密塞，搖勻，放置15 min后，以相應(yīng)的空白為參比，在510 nm處測定吸光度,并以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.012 3C-0.001 6(r=0.999 9)，表明對照品溶液在8.30～41.5 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度值之間呈良好線性關(guān)系。

1.2.5樣品含量測定精密吸取樣品溶液約2.0 mL，按“1.2.4”項(xiàng)下方法顯色，測定吸光度,計(jì)算總黃酮濃度。

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1精密度試驗(yàn)[5]精密吸取上述對照品溶液2.0 mL，按“1.2.4”項(xiàng)下方法顯色，測定吸光度，連續(xù)測定6次，結(jié)果吸光度測量值RSD為0.82%(n=6)，可表明儀器精密度良好。

2.1.2穩(wěn)定性試驗(yàn)[6]取樣品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下方法顯色，每隔1 h測定吸光度，結(jié)果吸光度測量值RSD=1.41%(n=4)，可表明，供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定，穩(wěn)定性良好。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)[7]精密稱取同一批樣品粉末6份，按“1.2.2”和“1.2.4”項(xiàng)下方法提取和顯色，測定吸光度并計(jì)算，結(jié)果總黃酮以蘆丁計(jì)算，平均含量為(12.33 mg·g-1)，RSD為1.33%(n=6)，表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4加樣回收率試驗(yàn)[8]精密稱取同一批樣品粉末6份，分別精密加入對照品，按照“1.2.2”和“1.2.4”項(xiàng)下方法提取和顯色，測得吸光度并計(jì)算，結(jié)果平均回收率為101.3%，RSD為2.99%(見表1)，表明本方法準(zhǔn)確可靠。

表1　總黃酮加樣回收率

2.2正交實(shí)驗(yàn)考察根據(jù)雪蓮十味片中各味藥的理化性質(zhì)及主要藥效，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、提取溫度(C)3個(gè)因素，以蘆丁含量為評價(jià)指標(biāo)，采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表2，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3、表4。

表2　因素水平表

表3　正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4　方差分析

注：F(0.05)=19.0。

從表3中可知以總黃酮為指標(biāo)的最佳條件為A2B3C3，影響次序?yàn)锳>C>B。從表4中可知三個(gè)因素中乙醇濃度對總黃酮含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提取時(shí)間和提取溫度則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。綜上，雪蓮十味片最佳提取條件為乙醇濃度75%，提取時(shí)間50 min，提取溫度55 ℃。

2.3最佳提取工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱取不同批次雪蓮十味片3份，每份約1.05 g，石油醚脫脂，按最佳提取條件A2B3C3平行操作，按“1.2.4”項(xiàng)下方法顯色，測得吸光度并計(jì)算，結(jié)果見表5，總黃酮平均含量為12.27 mg·g-1，RSD為0.9652%。

表5　總黃酮含量測定結(jié)果

3討論

亞急性甲狀腺炎(Subacute Thyroiditis，SAT)，是臨床常見的甲狀腺疼痛性疾病[9]，多見于30～50歲的女性，是男性的3～6倍。發(fā)病有季節(jié)性，冬、春季節(jié)是其發(fā)病的高峰。初期有上呼吸道感染癥狀，如發(fā)熱，寒戰(zhàn)、疲乏無力、食欲不振，續(xù)而出現(xiàn)甲狀腺部位的疼痛和壓痛常向頜下、耳后或頸部等處放射，咀嚼和吞咽時(shí)疼痛加重。臨床上常予以非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素治療，同時(shí)適時(shí)給予甲狀腺素緩解甲狀腺功能減低[10-14]。這些藥物均有不同程度的不良反應(yīng)。

雪蓮十味片為蒙醫(yī)傳統(tǒng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用多年，對治療疼痛性亞甲炎、扁桃體炎、上呼吸道感染等療效顯著，不良反應(yīng)較少，臨床療效顯著。其君藥苞葉雪蓮花為菊科植物苞葉雪蓮SaussureaObvallata(DC.)-Bip.的干燥地上部分，主要活性成分為黃酮類化合物[15-19]，大量實(shí)驗(yàn)表明黃酮類等生物活性成分有抗癌作用，抗氧化清除自由基，抗炎，抗菌抗病毒作用[20]。本實(shí)驗(yàn)對雪蓮十味片中的總黃酮的提取方法進(jìn)行了考察，并對其含量進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雪蓮十味片的總黃酮提取最佳工藝條件為使用石油醚脫脂后加入10倍量75%乙醇溶液，溫度為55 ℃下超聲提取50 min。此提取方法不僅工藝簡便快捷，還能提高雪蓮十味片的總黃酮提取率，為雪蓮十味片的深入研究和開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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(2015-09-15收稿責(zé)任編輯：張文婷)

Study on the Extraction of Total Flavonoids in Xuelian Shiwei Tablets

Su Miao,Hong Mei,Alatan Aorigele,Bao Lechaolu

(MongolianMedicineResearchInstituteofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China)

AbstractObjective:To study the ultrasonic extraction process of total flavonoids in Xuelian Shiwei tablet.Methods:Taking the total content of flavonoids as the detect index,and the orthogonal experiment design was adopted to investigate the best route for extracting the total flavonoids from Xuelian Shiwei tablets.Taking rutin as reference,and ultraviolet spectrophotometry was applied to determine the content of flavornoids.Results:The best method of extraction is 75% ethanol as solvent,at 55 ℃,for 50 mins under ultrasonic.The average extraction volume was 1.287 mg/g.Conclusion:This method is easy to operate,and can enhance the extraction rate in a large deal.

Key WordsXuelian Shiwei tablets; Total flavonoids; Orthogonal experiment; Ultraviolet spectrophotometry

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提升計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(編號：20090902)

作者簡介：蘇苗(1989.8—)，女，內(nèi)蒙古包頭市人，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)在讀研究生，研究方向：藥理學(xué)，E-mail：15148039326@139.com 通信作者：包勒朝魯(1976.10—)，男，內(nèi)蒙古錫林郭勒盟人，講師，碩士研究生，研究方向：蒙醫(yī)方劑劑型改革與安全性評價(jià)，Tel：(0471)6653173，E-mail：956613769@qq.com

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2016.06.041