烏丹降脂方對脂肪肝大鼠脂肪肝細(xì)胞氧化損傷調(diào)節(jié)作用研究

陳翠英，邵明亮，楊　莉，葉立紅，張　巍

(河北省石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050021)

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烏丹降脂方對脂肪肝大鼠脂肪肝細(xì)胞氧化損傷調(diào)節(jié)作用研究

陳翠英，邵明亮，楊莉，葉立紅，張巍

(河北省石家莊市第五醫(yī)院，河北 石家莊 050021)

[摘要]目的觀察烏丹降脂方對脂肪肝大鼠脂肪氧化損傷相關(guān)因子超氧化物歧化酶(SOD)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、活性氧(ROS)表達(dá)的影響。方法采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、多烯磷脂酰膽堿組、烏丹降脂組,正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余組均采用高脂飼料喂養(yǎng)法復(fù)制大鼠脂肪肝模型。喂養(yǎng)6周后，烏丹降脂組給予烏丹降脂方0.07 g/(100 g·d)灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予多烯磷脂酰膽堿24.6 mg/(100 g·d)灌胃，模型組和正常組給予相同劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)6周。實驗結(jié)束后采用ELISA法檢測各組血清CRP含量及SOD活性，West-blot法檢測肝組織中ROS表達(dá)情況，鏡下觀察肝組織病理變化。結(jié)果模型組血清 CRP含量及肝組織中ROS表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，SOD活性明顯低于正常組(P<0.05)；多烯磷脂酰膽堿組與烏丹降脂組血清CRP含量及肝組織中ROS表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，SOD活性均明顯高于模型組(P均<0.05)，且烏丹降脂組血清CRP含量及SOD活性改善情況均明顯優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿組(P均<0.05)。結(jié)論烏丹降脂方通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞氧化損傷相關(guān)因子，改善肝細(xì)胞由于脂類代謝異常形成的過氧化損傷，促進肝細(xì)胞功能恢復(fù)，具備一定的改善脂肪變性效果。

[關(guān)鍵詞]脂肪肝；中藥；烏丹降脂方；過氧化損傷

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，脂肪肝的發(fā)病率逐年增高，據(jù)2014年最新統(tǒng)計人群平均發(fā)病率為15%，40～49歲男性發(fā)病率達(dá)28%，已成為威脅人類健康僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，其病理過程包括單純性脂肪肝，進一步發(fā)展為脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化，甚至發(fā)展為肝癌[1]。中醫(yī)臨床辨證多將脂肪肝歸為“脅痛”“積證”“痰證”等范疇，其病因與外邪、飲食、情志以及勞逸密切相關(guān)，病機則與肝郁、痰濕、脾虛、血瘀等密不可分[2]。 自擬烏丹降脂方即根據(jù)中醫(yī)辨治原則所設(shè)，具有疏肝行氣、燥濕化痰、疏肝解郁功效，但其作用機制尚不明確。本研究觀察了烏丹降脂方對脂肪肝大鼠脂肪氧化損傷相關(guān)因子超氧化物歧化酶(SOD)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、活性氧(ROS)表達(dá)的影響，以期為脂肪肝的辨證施治提供理論依據(jù)。

1實驗資料

1.1實驗動物及分組選取SD大鼠40只，12周齡，體質(zhì)量200 g，動物許可證號：1502095。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常組、模型組、多烯磷脂酰膽堿組、烏丹降脂組，每組10只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2藥物與試劑烏丹降脂方主要成分為丹參、澤瀉、生山楂、何首烏、決明子、茵陳，均購自河北省樂仁堂醫(yī)藥有限公司，經(jīng)有經(jīng)驗藥師鑒定后使用。將原藥按1∶1∶0.5∶1∶1.5∶0.5比例加雙蒸水充分浸泡，在煎藥機中熬制，配制成41.667 g/L的溶液備用，冀藥制字：Z20051051。CRP、SOD ELISA試劑盒和兔抗鼠ROS抗體均購自博士德生物工程有限公司 。

1.3造模及給藥方法正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余組采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇、10%豬油)喂養(yǎng)復(fù)制大鼠脂肪肝模型。喂養(yǎng)6周后，按照大鼠的給藥劑量為成年人劑量6.3倍計算[3]，烏丹降脂組給予烏丹降脂方0.07 g/(100 g·d)灌胃，多烯磷脂酰膽堿組給予多烯磷脂酰膽堿24.6 mg/(100 g·d)灌胃，模型組和正常組給予相同劑量生理鹽水灌胃，連續(xù)6周。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1血清CRP及SOD活性實驗結(jié)束后，隔夜禁食,腹腔戊巴比妥麻醉,心臟采血,常規(guī)制備血清，按ELISA試劑盒說明書檢測各組大鼠血清CRP含量及SOD活性。

1.4.2肝組織中ROS表達(dá)情況采用West-blot法檢測。處死大鼠后取出肝臟,取部分肝組織塊于平皿中，加入PBS漂洗，切下約黃豆大小的肝組織放入手動勻漿器中，在冰上迅速碾磨直至呈現(xiàn)云霧狀。加入組織裂解液約500 μL(裂解液∶PMSF=100∶1)，冰上作用20～30 min，吸取組織液到已高壓滅菌的Ep管中，4 ℃離心，12 000 r/min×15 min。 取出EP管放在冰盒內(nèi),仔細(xì)吸取上清，取2 μL的上清用于蛋白濃度的測定，剩余上清按蛋白∶5×buffer=4∶1的比例加入5×buffer,煮沸10 min，瞬時離心，放入-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩Ｅ渲芐DS-聚丙烯酰胺凝膠，加入蛋白樣品，濃縮膠電泳恒流28 mA，約1 h。分離膠電泳15 V/cm(100/120 V),指示劑至分離膠底部，電泳完畢。裁下的凝膠泡入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，裁取同樣大小的NC膜，從負(fù)極到正極按照纖維帕、3塊濾紙、PAGE膠、膜、3塊濾紙順序用滴管邊加轉(zhuǎn)膜緩沖液逐層鋪好，加好轉(zhuǎn)膜夾，放入轉(zhuǎn)膜槽中，100 V/200 mA ，轉(zhuǎn)膜約2 h。將膜浸入封閉液中封閉1 h，加入1∶800用1×TBS稀釋的二抗，37 ℃ 1 h。免疫顯色。

1.4.3肝組織病理檢查取甲醛固定肝組織，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后進行顯微鏡下觀察，判斷各組脂肪肝程度。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組血清CRP含量及SOD活性模型組血清 CRP含量明顯高于正常組(P<0.05)，SOD活性明顯低于正常組(P<0.05)；多烯磷脂酰膽堿組與烏丹降脂組血清 CRP含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，SOD活性均明顯高于模型組(P均<0.05)，且烏丹降脂組改善情況明顯優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組血清CRP含量及SOD活性

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與多烯組比較，P<0.05。

2.2各組肝組織中ROS表達(dá)情況模型組ROS表達(dá)量明顯高于正常組(P<0.05)，多烯磷脂酰膽堿組和烏丹降脂組ROS表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖1。

圖1　各組肝組織中ROS表達(dá)情況

2.3各組肝組織病理檢查結(jié)果正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常；模型組肝細(xì)胞明顯脂肪變性，多分布在核的周圍。多烯磷脂酰膽堿組肝細(xì)胞腫脹，脂肪變性改善不明顯。烏丹降脂組肝細(xì)胞脂肪變性程度明顯改善。見圖2～5。

圖2　正常組肝組織病理表現(xiàn)(×100)

3討論

目前研究發(fā)現(xiàn)，脂肪肝細(xì)胞存在明顯的ROS含量升高，線粒體結(jié)構(gòu)功能異常，而線粒體是細(xì)胞內(nèi)合成ROS的重要場所[4]。在正常情況下，人體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡，當(dāng)機體受到某些因素刺激處于應(yīng)激狀態(tài)時，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，細(xì)胞內(nèi)ROS升高超過其清除能力，在體內(nèi)蓄積引起生物大分子、細(xì)胞乃至組織損傷[5]。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS不僅直接攻擊細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)、核酸等組分，還可激活多種細(xì)胞內(nèi)信號通路促進炎癥反應(yīng)，加速胞外基質(zhì)分泌，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時進一步加速ROS的合成[6]。作為與ROS產(chǎn)生距離最近的線粒體相關(guān)組分也成為ROS攻擊的首要靶目標(biāo)，進而誘導(dǎo)線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)與功能異常，導(dǎo)致線粒體功能障礙，加速ROS的生成，導(dǎo)致惡性循環(huán)[7]。SOD、CRP是參與肝細(xì)胞急性損傷修復(fù)的重要成分，是否與ROS的誘導(dǎo)有關(guān)尚未可知。SOD是抗氧化酶類的代表，包括位于胞漿的CuZn-SOD、位于線粒體的Mn-SOD和分泌到細(xì)胞外的Fe-SOD 3種，能夠清除超氧陰離子自由基，保護細(xì)胞免受氧化損傷，其活性水平代表細(xì)胞的抗氧化能力[8]。

圖3　模型組肝組織病理表現(xiàn)(×100)

圖4　多烯磷脂酰膽堿組肝組織病理表現(xiàn)(×100)

圖5　烏丹降脂組肝組織病理表現(xiàn)(×100)

中醫(yī)認(rèn)為,脂肪肝的形成多與過食肥甘厚味，過度肥胖或感受濕熱疫毒，或情志失調(diào)或久病體虛以及食積、氣滯血瘀等有關(guān)。各種致病因素?fù)p傷脾胃,脾不化濕,郁久成痰,而痰濕之邪阻礙氣機,使肝失疏泄,濕熱內(nèi)蘊，痰濕瘀阻互結(jié)，痹阻肝臟脈絡(luò)而形成脂肪肝[9]。故治以疏肝行氣、燥濕化痰為主，各醫(yī)家均根據(jù)臨床經(jīng)驗在辨證的基礎(chǔ)上提出自己獨特的治法以及相應(yīng)的方藥。烏丹降脂方中何首烏益腎填精,山楂消食化瘀降脂,澤瀉健脾利濕，丹參活血化瘀，茵陳清熱利濕疏肝，決明子清肝瀉火，各方相互配伍具有降脂功效。藥理學(xué)研究證實，何首烏所含二苯乙烯苷成分對用過氧化玉米油所致脂肪肝大鼠肝功能損害及肝中過氧化脂質(zhì)含量升高有明顯對抗作用，何首烏所含的多量磷脂酰膽堿尚能阻止TC在肝內(nèi)沉積[10];丹參能降低TG，作用機制是促進脂肪在肝中的氧化作用，從而降低肝內(nèi)脂質(zhì)含量；決明子所含蛋白質(zhì)和蒽酯苷均可降低高血脂癥大鼠的TC、TG和LDL-C[11]；澤瀉可選擇性抑制外源性TG、TC的吸收，影響內(nèi)源性TC代謝及抑制肝內(nèi)TG的合成，通過影響與TC有關(guān)的酶及抑制肝內(nèi)TG的合成而抗脂肪肝[12]。

本研究結(jié)果顯示，模型組血清 CRP含量及肝組織中ROS表達(dá)量均明顯高于正常組，SOD活性明顯低于正常組；多烯磷脂酰膽堿組與烏丹降脂組血清 CRP含量及肝組織中ROS表達(dá)量均明顯低于模型組，SOD活性均明顯高于模型組，且烏丹降脂組血清CRP含量及SOD活性改善情況均明顯優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿組。提示烏丹降脂方通過調(diào)節(jié)肝細(xì)胞氧化損傷相關(guān)因子，改善肝細(xì)胞由于脂類代謝異常形成的過氧化損傷，促進肝細(xì)胞功能恢復(fù)，具備一定的改善脂肪變性效果，但具體有效成分及其作用機制有待進一步研究。

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Study on the regulation of Wudanjiangzhi decoction on peroxidation damage in liver cells of the rats with liver fat

CHEN Cuiying, SHAO Mingliang, YANG Li, YE Lihong, ZHANG Wei

(The Fifth Hospital of Shijiazhuang, Shijiazhuang 050021,Hebei,China)

Abstract：Objective It is to observe the effect of Wudanjiangzhi decoction on correlated factors of peroxidation injury SOD, CRP ROS in fatty liver rats. Methods The rats were randomly divided into 4 groups by random number method: normal group, model group, polyene phosphatidyl choline group, Wudan jiangzhi group.The rats in normal group were fed with normal diet, the rats in the other groups were fed with high fat diet to establish fatty liver models. After feeding for 6 weeks, Wudanjiangzhi group was given 0.07 g/(100 g·d) by lavage, polyene phosphatidyl choline group was given polyene phosphatidyl choline 24.6 mg/(100 g·d) by lavage, the normal group and model group were given the same dosage of normal saline. All the groups were treated for 6 weeks. After treatment, serum CRP content and SOD activity were detected by ELISA, the expression of ROS was detected by West-blot method, the pathological changes of liver tissue was observed under microscope. Results The content of CRP and expression of ROS were higher while activity of SOD was lower in model group than that in normal group (P<0.05).The content of CRP and expression of ROS were lower while activity of SOD was higher in polyene phosphatidyl choline group, Wudan jiangzhi groupmodel group than that in normal group (P<0.05), and the improvements of CRP and SOD in Wudanjiangzhi group were better than those in polyene phosphatidyl choline group. Conclusion Wudanjiangzhi could improve liver cell peroxidation damage due to the formation of abnormal lipid metabolism by regulating liver mitochondrial function, reduce inflammatory mediators, promote the recovery of liver function, it have a certain therapeutic effect.

Key words:fatty liver; Wudanjiangzhi decoction; peroxidation damage

[作者簡介]陳翠英，女，主任醫(yī)師，主要從事代謝性肝病機制研究。 [通信作者]張巍，E-mail：wygbyjs@163.com

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.20.005

[中圖分類號]R-332

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)20-2180-04

[收稿日期]2015-12-03