黃精地龍方對體外培養分化的SH-SY5Y細胞Aβ25-35損傷中的保護作用研究

肖移生，曾元鳳，侯吉華，李　青

(1. 江西中醫藥大學基礎醫學院，江西 南昌 330004；2. 江西省人民醫院，江西 南昌 330006)

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論著

黃精地龍方對體外培養分化的SH-SY5Y細胞Aβ25-35損傷中的保護作用研究

肖移生1，曾元鳳2，侯吉華1，李青1

(1. 江西中醫藥大學基礎醫學院，江西 南昌 330004；2. 江西省人民醫院，江西 南昌 330006)

[摘要]目的探討黃精地龍方(RPEWM) 對體外培養分化的SH-SY5Y細胞Aβ25-35損傷的影響。方法SH-SY5Y細胞經維甲酸誘導分化，再經Aβ25-35造成細胞老年癡呆(AD)損傷，觀察不同濃度RPEWM提取液對損傷后的細胞形態學、細胞增殖情況及培養液中MDA、LDH含量，細胞中SOD、GSH-Px活性和細胞內游離鈣含量、Caspase-3酶活性的影響。結果RPEWM提取液在10～125 mg/L濃度范圍內能明顯抗細胞AD損傷，促進細胞增殖；RPEWM提取液30，60，90 mg/L均能明顯降低MDA、LDH含量及細胞內鈣離子、Caspase-3酶活性，升高細胞內SOD、GSH-Px酶活性，且呈劑量依賴性。結論RPEWM對分化的SH-SY5Y細胞Aβ25-35損傷有良好的保護作用，對AD有一定治療作用。

[關鍵詞]黃精地龍方；SH-SY5Y細胞；Aβ25-35；老年癡呆

老年癡呆(Alzheimer’s disease，AD) 是嚴重危害廣大老年人身心健康的常見病、多發病之一，但至今臨床醫療尚缺乏特異性、高效性治療藥物，因此從我國中醫藥中開發具有腦神經細胞保護的藥物具有十分重要的意義。黃精地龍方(Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures，RPEWM)系本課題組依據中醫理論自創方，前期研究發現該方具有明顯抗大鼠及小鼠老年癡呆作用[1-2]。為進一步闡述該方對體外培養的神經細胞是否具有保護作用，本研究以人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞)經維甲酸誘導分化，再經Aβ25-35致細胞AD損傷，探討RPEWM抗神經細胞損傷機制。

1實驗資料

1.1藥物RPEWM由黃精、地龍兩味中藥按1∶1組成。黃精與地龍均購自江西中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房，并經江西中醫藥大學中藥生藥教研室鑒定地龍屬于廣地龍、黃精屬于多花黃精，且均符合國家中藥臨床應用標準。人參皂甙Rb1標準品購自中國藥品生物制品檢定所 (純度≥99.9%)。RPEWM濃縮提取液制備[3]：將黃精100 g、地龍100 g用超微粉碎機粉碎后，常溫下將黃精、地龍粉以1∶1比例混合，加1 000 mL蒸餾水浸漬，不時攪拌使其充分浸泡12h；沸水回流2h，濾過，收集提取液，向粗濾后的殘渣內再加1 000 mL蒸餾水(100 ℃)，并再次沸水回流1 h，濾過，收集提取液；合并2次提取液后離心(2 000 r/min，20 min)，收集上清液，旋轉蒸發濃縮形成200 mL濃縮液(每1 mL相當含生藥1 g)為實驗用的RPEWM濃縮提取液，過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.2試劑胎牛血清及DMEM/F12培養基為Gibco公司產品；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 檢測試劑盒均為福建邁新生物技術公司產品；胰蛋白酶、全反式維甲酸、Aβ25-35、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、Fura-2/Am 均為Sigma公司產品；鈣離子濃度校正試劑盒為Invitrogen公司產品；Caspase-3檢測試劑盒為Biovision公司產品；其余試劑均為國產分析純級試劑。

1.3儀器752分光光度計為上海醫用分析儀器廠產品，多功能熱回流中藥提取濃縮機為上海定泰蒸發器有限公司產品，熒光分光光度計及酶標儀為美國THERMO FISHER公司產品，其他均為常用儀器。

1.4SH-SY5Y細胞培養SH-SY5Y細胞購自中國科學院上海細胞(庫)中心，以5.0×104mL-1細胞濃度置于含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養液中培養，用于后續實驗。

1.5AD細胞模型建立參照文獻[4-5]方法，SH-SY5Y細胞接種培養24 h后，加入終濃度為1 μmol/L的全反式維甲酸處理細胞3 d來誘導其分化，再加入10 μmol/L的Aβ25-35作用細胞48 h，建立AD細胞模型。

1.6細胞增殖率測定采用MTT法測定。細胞置于96孔培養板內培養，經維甲酸誘導分化后，分成正常組、損傷組、人參皂甙組、RPEWM提取液組(包括9個濃度組)。RPEWM提取液組加入Aβ25-35處理的同時，分別加入1，5，10，25，50，75，100，125，150 mg/L的RPEWM提取液保護，繼續培養48 h后行MTT法檢測，以尋找藥物的有效濃度范圍，得出量效關系；人參皂甙組加入Aβ25-35處理的同時加入人參皂甙Rb1(終濃度為50 mg/L) 保護；損傷組只加入Aβ25-35處理；正常組經維甲酸誘導分化后不加Aβ25-35，也不加藥物保護。每組細胞10個復孔，且實驗重復10次。到時間點后，各孔加入MTT液20 μL/孔，4h后終止培養，棄去上清，加入DMSO(100 μL/孔)，振蕩使結晶物溶解，用自動酶標儀波長570 nm處測吸光度值(D570)，以D值高低表示細胞活力的高低。

1.7MDA、LDH含量及SOD、GSH-Px活性測定細胞置于24孔培養板內培養，待細胞分化好后，分成正常組、損傷組、人參皂甙組、RPEWM 30 mg/L組、RPEWM 60 mg/L組、RPEWM 90 mg/L組(根據MTT檢測結果得出RPEWM提取液的有效濃度范圍分組)，培養方法同1.6。到時間點后，收集各組各孔內的培養液，定量取部分培養液按試劑盒說明書操作進行MDA、LDH含量測定。細胞用PBS漂洗2遍，每孔加入含0.05 mmol/L EDTA的PBS 200 μL(pH 8.0)，再加入1%的Triton-X100 100 μL，將培養板置于振蕩器振蕩2 min使細胞裂解并溶解，然后加入25% H3PO4100 μL以沉淀蛋白，低溫離心(10 000 r/min)30 min，取沉淀物按說明書測定SOD、GSH-Px活性。蛋白質定量用Lowry法。

1.8細胞內游離鈣([Ca2+]i)含量、Caspase-3酶活性測定 用20 mL培養瓶培養細胞，其余過程及實驗分組同SOD、LDH、MDA、GSH-Px測定實驗。到時間點后，收集各組細胞分別制備成1×109mL-1的細胞懸液。

1.8.1[Ca2+]i含量測定各組分別取100 μL細胞懸液置于96孔培養板內，加入終濃度為2 μmol/L的Fura-2/Am，于37 ℃恒溫振蕩40 min；再用熒光分光光度計進行熒光測定，游離時Fura-2的激發波長為340 nm，結合Fura-2的激發波長為420 nm，分別測定這兩個波長下的熒光強度，求出其比率(R)。再按公式[Ca2+]i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R) 計算各組細胞內[Ca2+]i的含量，Kd為224 nmol/L，Rmin為最小熒光值(由懸液內加入EDTA后的測量值)，Rmax為最大熒光值(由懸液內加入1% Triton-X100后的測量值)。

1.8.2Caspase-3活性測定各組分別取100 μL細胞懸液置于96孔培養板內，在每孔中依次加入80 μL檢測緩沖液，10 μL待測樣品蛋白，10 μL AcDEVD-PNA(2 mmol/L)，37 ℃孵育4 h，上酶標儀于405 nm波長處檢測各組細胞的Caspase-3活性，詳細步驟見檢測試劑盒說明書。蛋白質定量用Lowry法。

2結果

2.1細胞形態學觀察SH-SY5Y細胞具有類神經細胞(元) 形態，但突起少、短，不長于胞體。經維甲酸誘導1 d后細胞形態發生改變，胞體上伸出多突起；3 d后分化為神經細胞樣形態更明顯，突起更多、更長，且有分支，分支之間有相連。分化細胞經Aβ25-35處理48 h后損傷較明顯，細胞折光性差，胞體變圓，突起回縮，突起間的網狀連結消失，培養液中有較多漂浮細胞。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L組的細胞形態也較差，與損傷組的細胞形態相似。10 mg/L以上的RPEWM提取液能減輕細胞損傷，細胞生長良好，突起伸展長，漂浮細胞不明顯，且藥物的保護作用隨劑量增加越明顯。

2.2MTT檢測結果正常組吸光度為0.743±0.041，損傷組為0.333±0.036，人參皂甙組為0.672±0.053，RPEWM 1，5，10，25，50，75，100，125，150 mg/L各組吸光度分別為0.318±0.018，0.366±0.010，0.515±0.044，0.538±0.057，0.642±0.058，0.681±0.049，0.697±0.064，0.725±0.059，0.717±0.060。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L組的細胞增殖率與損傷組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；RPEWM 10 mg/L以上組的細胞增殖率均高于損傷組(P均<0.05)，且隨劑量增加，細胞增殖率越高，AD細胞保護作用越明顯；RPEWM 125 mg/L組的細胞增殖率最高，150 mg/L組的細胞增殖率不再升高，說明此濃度進入藥效曲線平臺。故后續實驗中，將RPEWM提取液濃度設為30，60，90 mg/L 3個劑量組。

2.3各組MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比較損傷組培養液中MDA、LDH含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，細胞中SOD、GSH-Px活性均明顯低于正常組(P均<0.05)。RPEWM各組培養液中MDA、LDH含量明顯低于損傷組(P均<0.05)，細胞中SOD、GSH-Px活性明顯高于損傷組(P均<0.05)，且呈劑量依賴性。見表1。

表1　各組MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

2.4各組細胞內[Ca2+]i含量、Caspase-3活性比較損傷組細胞內[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明顯高于正常組(P均<0.05)；RPEWM各組細胞內[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明顯低于損傷組(P均<0.05)，且呈劑量依賴性。見表2。

表2　各組細胞內[Ca2+]i含量、Caspase-3

注：①與正常組比較，P<0.05；②與損傷組比較，P<0.05。

3討論

AD等腦髓病其實質是腦神經細胞受到各種損傷因子影響，最終導致神經細胞死亡，從而出現不同的臨床癥狀。已有研究證實Aβ是各種原因誘導AD的共同通路，可導致神經細胞變性、神經纖維纏結、神經細胞死亡；而Aβ25-35是Aβ主要活性片段，其神經毒性已被大量研究證實[6]。因此，抗Aβ導致的神經細胞損傷可作為AD治療關鍵。SH-SY5Y細胞來源于人神經母細胞瘤，其某些生理功能及生物學特性與正常神經元有相似之處，再經維甲酸誘導后能分化為神經細胞[4]。

本研究MTT檢測結果顯示，10 mg/L以上的RPEWM提取液能提高AD細胞增殖率，顯示出良好的抗Aβ25-35致神經細胞AD損傷作用，且隨藥物濃度增加，細胞保護作用越明顯。當RPEWM提取液濃度達125 mg/L時，其藥效達到頂峰，由此得出RPEWM提取液抗神經細胞AD損傷的有效劑量范圍在10～125 mg/L。

各種自由基是損傷體細胞的重要因子，尤其是氧自由基，能使線粒體膜的多不飽和脂肪酸(PUTA) 過氧化，損傷其結構與功能，引發能量代謝障礙，最終導致細胞功能障礙。MDA是PUTA過氧化的分解物，可間接反映自由基對細胞的損害程度。細胞內有大量的LDH，很少漏出細胞外，但當細胞受損后，LDH漏出量顯著升高，故檢測細胞外液中的LDH量可反映細胞受損程度。SOD是一種自由基清除酶，其活性高低可以反映細胞對自由基的清除能力。GSH-Px是細胞內抗脂質過氧化的一種重要酶，它能特異性催化GSH對H2O2的還原反應，保護細胞膜結構和功能的完整，其活性強弱也可以反映細胞抗氧化能力的大小。本實驗結果顯示，Aβ25-35致細胞AD損傷后培養液中MDA、LDH含量顯著升高，細胞中SOD、GSH-Px活性顯著降低；RPEWM各組培養液中MDA、LDH含量顯著降低，細胞中SOD、GSH-Px活性顯著升高，且呈劑量依賴性，說明RPEWM能增加細胞自由基清除能力，抑制脂質過氧化，減少單胺類神經遞質的氧化分解，從而發揮抗神經細胞損傷作用。這與文獻[3-4]結果相一致，進一步證實了RPEWM抗自由基、抗氧化及神經保護作用的有效性、穩定性和可重復性。

細胞內的鈣離子主要由細胞膜上的電壓依賴性鈣通道、鈣泵耗能來維持，當細胞受損傷時，線粒體能量代謝障礙，鈣泵不能主動把細胞內的鈣泵出細胞外；另外，脂質過氧化也會促使電壓依賴性鈣通道開放，進而鈣離子內流，引發鈣超載[7]。細胞內過量的鈣離子是引發細胞凋亡的始動因子之一，啟動核酸內切酶，引起凋亡相關基因表達，最終激活Caspase-3，導致細胞凋亡。本研究中發現Aβ25-35致細胞AD損傷后細胞內鈣離子含量明顯增加，Caspase-3活性顯著升高；RPEWM提取液能明顯降低細胞內鈣離子含量及Caspase-3活性，抑制Aβ25-35致細胞AD損傷后的細胞壞死或凋亡發生。

綜上所述，Aβ25-35致神經細胞AD損傷會引起細胞內自由基大量增加，脂質過氧化、細胞內鈣離子超載，進而引發神經細胞壞死或凋亡；RPEWM有良好的抗神經細胞AD損傷作用，其機制與抗自由基、抗氧化、抗鈣超載、抗凋亡等有關。

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Protective effects of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells

XIAO Yisheng1, ZENG Yuanfeng2, HOU Jihua1, LI Qing1

(1. The Basic Medicine College of Jiangxi University of TCM, Nanchang 330004, Jiangxi, China; 2. Jiangxi Province People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the functions of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures (RPEWM) on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells. Methods The SH-SY5Y cells were differentiated to neuron by ATRA, then they were impaired by Aβ25-35 as the Alzheimer’s disease (AD) injury to cells, at the same time, the extraction of RPEWM were added to cells act as protector. Finally, we investigated the morphological behavior, survival rate, detected the SOD, LDH, MDA, GSH-Px levels, observed the intracellular calcium levels ([Ca2+]i), Caspase-3 activites of the AD model’s cells. Results Compared with model group, the extraction of RPEWM at the dose of 10-125 mg/L could significantly anti-AD impair to neuron cells, increase the cell viability and survival rate. Also, the extraction of RPEWM at the dose of 30, 60, 90 mg/L could decrease the [Ca2+]i, MDA, LDH level, lower Caspase-3 activites, and activate SOD, GSH-Px activites of the AD model’s cells. Conclusion RPEWM possess the function of anti-AD, can effectively protect the differentiated SH-SY5Y cells against AD impairment which exerted by Aβ25-35.

Key words:The Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures; SH-SY5Y cell; Aβ25-35; Alzheimer’s disease

[作者簡介]肖移生，男，碩士，副教授，研究方向為中藥抗衰老、抗腫瘤研究。 [通信作者]侯吉華，E-mail：794706902@qq.com

[基金項目]2014年江西省衛生計生委中醫藥科研基金項目(2014A014)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.20.001

[中圖分類號]R-33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)20-2167-04

[收稿日期]2016-01-17